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应用流式细胞术研究剪切力诱导的血小板活化

作　者: 李绵洋
导　师: 丛玉隆；胡金麟
学　校: 军医进修学院
专　业: 临床实验诊断学
关键词: 血小板剪切力诱导剂血小板聚集糖蛋白 Fluo-3/AM 钙离子流式细胞仪锥板黏度计
分类号: R318.01
类　型: 硕士论文
年　份: 2001年
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内容摘要

目的：本实验采用改制的锥板黏度计提供流体剪切力，用流式细胞术(FCM)研究剪切力对血小板的直接激活作用，包括剪切力诱导的血小板聚集的变化规律、参与血小板聚集的各种受体和血浆介质、剪切力作用过程中血小板表面糖蛋白GpⅠb／Ⅸ、GpⅡb／Ⅲa、活化的GpⅡb／Ⅲa(PAC-1)以及 CD62P的变化规律、血小板信息传递物质钙离子的变化规律，以探讨剪切力活化血小板的可能机制。本实验还对部分动脉血栓性疾病的高剪切力诱导的血小板聚集进行检测，初步探讨其在临床中的应用价值。方法：采集2w内未服任何药物的健康者静脉全血，3．8％枸橼酸钠 1：9抗凝，常规方法制备PRP及PPP。(1)用锥板黏度计对全血标本施加剪切力作用，再以CD61 PerCP单克隆抗体荧光染色，FCM方法分析血小板聚集率。(2)对全血标本处理后测定剪切力诱导的血小板聚集：以血小板相关的纯化单克隆抗体(20μg／ml)、RGDS与全血标本混匀，37℃孵育 10min；以 ADP、肾上腺素与全血标本混匀，37℃孵育 1min；洗涤标本或加入钙离子或加入EGTA；以阿司匹林、噻氯匹定与全血标本混匀，37℃孵育30min。(4)全血标本用其自身PPP 稀释5倍后，用FCM方法测定剪切力作用后血小板表面膜糖蛋白GpⅠb／Ⅸ、GpⅡ／Ⅲa 和血小板活化标志物PAC-1、 CD62P。(5)以终浓度20μmol／L的Fluo-3 AM标记全血标本，用其自身卯P稀释5倍后，用nM方法测定剪切力作用后的血小板Ca‘”水平。仰测定不同疾病的剪切力诱导的血小板聚集率和剪切力作用前后血，J、板活化标志物＊C习、CD62P表达水平，包括急性心肌梗死、脑梗死、TIA、糖尿病伴血管病变和MDS。结果：1．全血标本在低剪切力作用下，只有少量的血小板聚集，随着剪切力的增大，M，J、板聚集率逐渐增大。20005－‘ 剪切作用30s即可发生明显的血小板聚集，3min接近最大。 2．用单克隆抗体阻断b fo／IX、Gp 11 b／llla与州F之间结合，使高剪切力诱导的血小板聚集明显降低，而阻断 G P 11b ／illa 与 Fg结合后血小板聚集率无明显降低；加入 Ca‘”促进高剪切力诱导的血小板聚集，而加入 EGT＾则产生抑制作用；低浓度的ADP、肾上腺素单独作用，诱导的血小板聚集微弱，但与高剪切力作用存在明显的协同作用；经典的抗血小板药物阿司匹林对高剪切力诱导的血小板聚集没有明显的抑制作用，而嗡氯匹定抑制作用明显。3．在低剪切力下，血小板表面 G plb ／IX无明显变化，随着剪切力的增大，先是有所增加，随后开始持续下降；G p 11 b／llla 在低剪切力作用下，就开始增加，随着剪切力的增大，G p 11b ／illa在短时间内迅速增高，至7min，开始下降；PAC＜在不同剪切力作用均有明显的表达，剪切力越大，PAC八表达越高，且在较短的时间内就开始下降；CD62P的表达在低剪切力作用时不明显，在10005‘ 以上的剪切力作用下，CD62P的表达呈线性上升。4．FCM方法测定高剪切力作用后血小板的Ca卜水平发生明显的增高，然后逐渐下降；GP b／IX单抗处理、加入EGTA 能抑制此增高，RGDS阻断 Gp 11b ／illa与 vWF间结合对血小板钙离子增高无明显作用，加入 Ca‘”促进血小板 Ca‘”增高；低浓度的 ADP 与高剪切力对血小板Ca卜的增高有协同作用。5．A皿、脑梗－2－死、TIA、糖尿病病人的血小板聚集率高于正常对照，血小板活化标志物＊C＜、CD6旺增高；MDS病人血。J、板聚集率明显偏低，PAC刁、CD6 ZP与正常对照比较无明显差异，但在高的剪切力作用后表达低于正常人的表达。结论：全血血小板在高剪切力作用下，不需要加入外源性化学诱导剂就可发生明显的聚集。在聚集的同时发生表面糖蛋白规律性变化和血小板内钙离子的增高。综合实验的结果，高剪切力活化血小板的基本机制可能为：高血流剪切力作用使血液可溶性 VWF多聚体或 Gp b／IX复合物构型发生变化，＝者之间的亲和力增加，结合后与 G p 11b ／illa发生转位，激活血小板膜上钙离子通道，形成跨膜钙离子内流，血小板胞浆钙离子浓度增高，作为血小板激活的信使激活了血小板 G p 11b ／illa，后者与

全文目录

  4-6
  6-7
  7-9
  9-10
前言  10-11
材料与方法  11-16
结果  16-33
讨论  33-40
小结  40-41
  41-45
综述一  45-55
综述二  55-67
致谢  67-68

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