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放线菌SPRI-38490的菌种鉴定及其次次级代谢产物中除草活性组分研究

作　者: 苏超
导　师: 陶黎明
学　校: 华东理工大学
专　业: 农药学
关键词: 菌种鉴定 微生物发酵 分离提纯 结构鉴定 高效液相色谱 除草素A
分类号: S482.49
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


通过筛选,发现了放线菌SPRI-38490,它可以产生除草活性的代谢产物。本文对其进行了菌种鉴定,同时研究了其具有除草活性的次级代谢产物。通过形态学观察、培养特征、生理生化特征研究以及16S rDNA基因序列分析,对放线菌SPRI-38490进行了分类鉴定,确定其为放线链霉菌属结节链霉菌(Streptomyces nodosus)中的一员。将菌株SPRI-38490的发酵液进行了硅胶柱层析、薄层层析、高效液相制备等操作,分离纯化其代谢产物,得到了具有除草活性的化合物SPRI-38490-A。该物质经核磁共振(NMR)、质谱(MS)、紫外光谱(UV)等光谱学的分析,最终剖析出其分子式为C23H29N5O11,分子量为551。结合各种谱图综合分析,确定文献报道的除草素herbicidin A与其结构相同,并验证了其除草活性。同时通过研究,建立了用高效液相的方法分析发酵等过程中除草素A含量。通过与文献中报道过的除草素A产生菌对比,发现SPRI-38490是一个新的可产生除草素A的微生物菌种；此外,与其它产生菌在产生除草素A的同时还会产生其它组分的除草素不同,SPRI-38490的代谢产物中只发现了除草素A一种成分。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-12
第1章 文献综述  12-25
  1.1 背景资料——生物农药  12-17
    1.1.1 生物农药的定义与分类  12-16
      1.1.1.1 微生物源农药  12-13
      1.1.1.2 植物源农药  13-15
      1.1.1.3 动物源农药  15
      1.1.1.4 天敌昆虫  15-16
      1.1.1.5 转基因作物  16
    1.1.2 生物农药的发展与优点  16-17
  1.2 微生物除草剂  17-23
    1.2.1 微生物除草剂的分类与作用机制  17-19
    1.2.2 微生物除草剂的研究历史与现状  19-20
    1.2.3 微生物除草剂的主要研究成果  20-23
      1.2.3.1 已登记的微生物除草剂品种  20-22
      1.2.3.2 正在试用的微生物除草剂  22-23
    1.2.4 中国微生物除草剂的研究状况与展望  23
  1.3 本课题的立题背景及研究意义  23-25
第2章 实验设计与方案  25-32
  2.1 微生物的分离及菌种的生物筛选  26-27
  2.2 菌株个体形态及培养特征  27
  2.3 菌株生理生化特性测定  27-28
  2.4 全细胞糖分析以及全细胞氨基酸分析  28
  2.5 16S RDNA序列测定及分析方法  28
  2.6 活性组分在萃取液中的分布及热稳定性实验  28
  2.7 活性组分的分离提纯  28-31
    2.7.1 发酵液预处理  29
    2.7.2 溶剂萃取  29
    2.7.3 硅胶柱层析色谱分离  29-30
    2.7.4 HPLC纯化  30-31
  2.8 有效组分的结构鉴定  31
  2.9 生物活性测试跟踪  31-32
第3章 放线菌SPRI-38490的菌种鉴定  32-50
  3.1 材料试剂及仪器  32-34
    3.1.1 材料  32-33
      3.1.1.1 菌株  33
      3.1.1.2 培养基  33
    3.1.2 其他药品与试剂  33-34
    3.1.3 主要仪器  34
  3.2 实验方法  34-43
    3.2.1 菌株个体形态及培养特征  35
      3.2.1.1 菌株个体形态特征观察  35
      3.2.1.2 菌落培养特征观察  35
    3.2.2 菌株生理生化特性测定  35-37
      3.2.2.1 牛奶凝固与胨化测定  35
      3.2.2.2 明胶液化测定  35
      3.2.2.3 纤维素水解测定  35-36
      3.2.2.4 淀粉水解测定  36
      3.2.2.5 硝酸盐还原测定  36
      3.2.2.6 酪氨酸水解实验  36
      3.2.2.7 硫化氢产生实验  36-37
      3.2.2.8 碳源利用试验  37
    3.2.3 全细胞糖分析以及全细胞氨基酸分析  37-38
      3.2.3.1 制板  37
      3.2.3.2 收集菌体  37
      3.2.3.3 菌体水解  37
      3.2.3.4 点样  37-38
      3.2.3.5 展层与显色  38
    3.2.4 16S DNA的抽提、测序及分析  38-43
      3.2.4.1 菌丝体裂解  38
      3.2.4.2 PCR扩增  38-39
        3.2.4.2.1 引物  39
        3.2.4.2.2 反应混合液配制  39
        3.2.4.2.3 PCR反应条件  39
      3.2.4.3 琼脂糖凝胶电泳  39-40
        3.2.4.3.1 溶液配制及制胶  39-40
        3.2.4.3.2 电泳方法  40
      3.2.4.4 DNA的回收  40-41
      3.2.4.5 载体连接  41
      3.2.4.6 质粒DNA的抽提  41-42
      3.2.4.7 质粒DNA酶切鉴定  42
        3.2.4.7.1 酶切  42
        3.2.4.7.2 电泳  42
      3.2.4.8 测序  42
      3.2.4.9 系统发育树分析  42-43
  3.3 结果与讨论  43-50
    3.3.1 菌株SPRI-38490的培养特征  43
    3.3.2 葡萄糖天门冬素琼脂培养基上的菌株SPRI-38490个体形态特征  43
    3.3.3 菌株SPRI-38490的生理生化特征  43-44
    3.3.4 菌株SPRI-38490的全细胞糖分析  44-45
    3.3.5 菌株SPRI-38490的全细胞氨基酸分析  45-46
    3.3.6 16S RDNA测序及分析  46-47
      3.3.6.1 酶切产物电泳结果与分析  46
      3.3.6.2 16S RDNA测序结果  46
      3.3.6.3 系统进化树构建与分析  46-47
    3.3.7 菌株SPRI-38490与除草素A产生菌STREPTOMYCES NODOSUS的比较  47-49
    3.3.8 结论  49-50
第4章 抗生素SPRI-38490-A有效组分的分离提取及精制  50-57
  4.1 实验材料  50-51
    4.1.1 实验仪器  50
    4.1.2 材料与试剂  50-51
  4.2 实验方法  51-52
    4.2.1 放线菌SPRI-38490的发酵培养  51
    4.2.2 放线菌SPRI-38490发酵液预处理  51
    4.2.3 放线菌SPRI-38490产活性物质的稳定性研究  51-52
      4.2.3.1 温度对发酵液稳定性的影响  51
      4.2.3.2 不同PH条件下发酵液的稳定性  51-52
    4.2.4 硅胶柱层析色谱分离实验  52
    4.2.5 生物活性测试  52
  4.3 结果与分析  52-56
    4.3.1 放线菌SPRI-38490发酵液预处理研究结果  53
    4.3.2 PH及温度对发酵液中活性物质稳定性的影响  53
      4.3.2.1 温度对发酵液中活性物质稳定性的影响  53
      4.3.2.2 不同PH值下,活性物质的稳定性  53
    4.3.3 层析展开剂的选择以及活性带的确定  53-54
    4.3.4 硅胶柱层析色谱分离条件的确定和优化  54
    4.3.5 高效液相(HPLC)分析分离SPRI-38490-A  54-56
  4.4 纯品的提取工艺  56-57
第5章 放线菌SPRI-38490有效组分的谱图解析  57-60
  5.1 实验仪器  57
  5.2 谱图解析  57-59
    5.2.1 抗生素SPRI-38490-A的分子量  57-58
    5.2.2 抗生素SPRI-38490-A的碳和氢原子数目的初步确认  58-59
  5.3 讨论  59-60
第6章 抗生素SPRI-38490-A的生物活性测定及结果分析  60-62
  6.1 实验材料及方法  60-61
    6.1.1 实验材料  60
    6.1.2 实验步骤  60-61
  6.2 生物测定结果分析与讨论  61-62
第7章 抗生素SPRI-38490-A的分析方法的研究  62-66
  7.1 实验材料和方法  62-63
    7.1.1 仪器与溶剂  62
    7.1.2 高效液相色谱条件  62
    7.1.3 标准曲线的绘制  62-63
    7.1.4 样品预处理  63
  7.2 测定与计算  63-65
    7.2.1 外标法测定步骤  63
    7.2.2 效价计算  63-64
    7.2.3 测定方法的精密度  64
    7.2.4 测定方法的准确性-回收率的测定  64-65
    7.2.5 样品的高效液相分析  65
  7.3 结果讨论  65-66
第8章 结论及展望  66-68
参考文献  68-72
致谢  72

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 农药防治（化学防治） > 各种农药 > 除草剂（杀草剂） > 其他除草剂
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