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萝卜磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶的抗氧化功能研究

作　者: 刘冠兰
导　师: 段明星
学　校: 清华大学
专　业: 生物学
关键词: 活性氧萝卜谷胱甘肽过氧化物酶抗氧化
分类号: S631.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

已证实磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(Phospholipid Hydroperoxide Glutathione Peroxidase ,PHGPx)可以通过降低磷脂过氧化程度来防止膜过氧化损伤。自1982年PHGPx被作为一种过氧化抑制蛋白从猪肝脏中提取出以来,PHGPx的酶学功能和催化性质得到了广泛的研究。目前的发现已经证明,PHGPx可以作为氧化胁迫下的细胞保护剂。特别的是,在一些细胞模型中PHGPx可以在针对磷脂过氧化时扮演独特的作用。但是到目前为止,外源性的PHGPx蛋白对氧化胁迫下细胞体系的保护作用还未见报道。本文利用生物和化学的实验方法,建立了氧化胁迫的细胞模型;选取在原核细胞中高效表达、活性高、易纯化的萝卜磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(RsPHGPx),对其抗氧化作用进行了研究。通过细胞形态学检验、细胞活力测定以及细胞内脂质过氧化程度检测,研究了RsPHGPx对于细胞生长状况的影响。实验结果显示,在氧化胁迫的条件下,RsPHGPx预处理可以有效地维持正常的细胞形态、保持较高的细胞活力并且降低丙二醛(MDA)水平。此外,通过与RsPHGPx的失活突变体mRsPHGPx对照,证实RsPHGPx对细胞的这一保护作用是由其催化活性决定的。通过检测细胞内活性氧水平和凋亡情况,证明RsPHGPx的加入可以有效降低细胞内的活性氧水平,并且抑制氧化胁迫情况下的细胞凋亡。这一结果证实了RsPHGPx的处理可以通过清除活性氧的方式保护细胞。此外,本研究还进行了RsPHGPx与谷胱甘肽联合作用保护细胞的实验。结果证明,RsPHGPx的加入可显著提高谷胱甘肽对氧化胁迫下细胞的保护作用,从而高效地清除细胞内的活性氧。这一实验结果为复合型抗氧化制剂的研究提供了参考。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-9
第一章引言  9-33
  1.1 生物体内的活性氧和过氧化损伤  9-18
    1.1.1 活性氧简介和生物体内活性氧的产生  9-10
    1.1.2 活性氧的双重作用  10
    1.1.3 活性氧的危害  10-14
    1.1.4 活性氧的积极作用  14-16
    1.1.5 紫外照射和重金属离子导致活性氧积累  16-17
    1.1.6 生物体内的活性氧防御机制  17-18
  1.2 生物抗氧化制剂的研究进展  18-21
    1.2.1 SOD 的应用  18-19
    1.2.2 辅酶Q10 的应用  19-20
    1.2.3 维生素E 的应用  20-21
  1.3 谷胱甘肽和磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶  21-28
    1.3.1 谷胱甘肽简介  21-22
    1.3.2 谷胱甘肽的抗氧化作用  22-23
    1.3.3 磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶简述  23-25
    1.3.4 PHGPx 的分类及反应特性  25-28
    1.3.5 PHGPx 的应用  28
  1.4 萝卜磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶  28-30
    1.4.1 RsPHGPx 的序列分析和亚细胞定位  29
    1.4.2 RsPHGPx 的活性分析  29-30
  1.5 研究目的和研究内容  30-33
    1.5.1 研究目的  30-31
    1.5.2 研究内容  31-33
第二章 RsPHGPx 的表达和纯化  33-39
  2.1 实验材料  33-34
  2.2 实验方法  34-35
    2.2.1 突变体RsPHGPx(mRsPHGPx)基因的克隆和表达载体的构建  34
    2.2.2 RsPHGPx 和mRsPHGPx 的原核表达和纯化  34-35
    2.2.3 RsPHGPx 和mRsPHGPx 的酶活测定  35
  2.3 结果和讨论  35-38
    2.3.1 RsPHGPx/mRsPHGPx 基因的克隆及表达载体的构建  35-36
    2.3.2 重组蛋白纯化  36-37
    2.3.3 酶活性测定  37-38
  2.4 本章小结  38-39
第三章 RsPHGPx 保护细胞抵御过氧化损伤  39-57
  3.1 材料与仪器  40-41
    3.1.1 试剂  40-41
    3.1.2 主要仪器  41
    3.1.3 细胞系  41
  3.2 实验方法  41-45
    3.2.1 细胞培养和传代  41-42
    3.2.2 MTT 法检测细胞活力  42-43
    3.2.3 细胞内丙二醛（MDA）含量的测量  43
    3.2.4 胞内活性氧（ROS）水平检测  43-44
    3.2.5 细胞形态检测和活性氧荧光检测  44
    3.2.6 RsPHGPx 的作用时间对其保护作用的影响  44-45
    3.2.7 统计方法  45
  3.3 结果与讨论  45-56
    3.3.1 氧化剂浓度筛选和细胞氧化损伤模型的建立  45-46
    3.3.2 外源性RsPHGPx 保护细胞免受氢过氧化物的损伤  46-47
    3.3.3 加入RsPHGPx 的时间对其保护作用的影响  47-49
    3.3.4 细胞形态学观察  49-51
    3.3.5 RsPHGPx 的剂量选择  51-53
    3.3.6 RsPHGPx 可以降低细胞中ROS 的水平  53-56
  3.4 本章小结  56-57
第四章 RsPHGPx 和GSH 的联合作用  57-67
  4.1 材料与仪器  57-58
    4.1.1 试剂  57-58
    4.1.2 主要仪器  58
    4.1.3 细胞系  58
  4.2 实验方法  58-60
    4.2.1 RsPHGPx 的原核表达和纯化  58
    4.2.2 细胞培养  58-59
    4.2.3 细胞存活率和细胞膜脂质过氧化水平检测  59
    4.2.4 细胞内活性氧（ROS）的测定  59
    4.2.5 凋亡细胞的DAPI 染色法检测  59-60
    4.2.6 统计学分析  60
  4.3 结果和讨论  60-66
    4.3.1 RsPHGPx 和GSH 的浓度选择  60-61
    4.3.2 RsPHGPx 和GSH 联合作用保护细胞  61
    4.3.3 细胞内ROS 水平检测  61-62
    4.3.4 细胞形态检测  62-64
    4.3.5 细胞凋亡检测  64-66
  4.4 本章小结  66-67
第五章结论和展望  67-69
  5.1 结论  67-68
  5.2 展望  68-69
参考文献  69-75
致谢  75-76
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果  76

萝卜磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶的抗氧化功能研究

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