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渭北地区优质高产苹果园土壤微生物种群的研究

作　者: 周璇
导　师: 李丙智
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 果树学
关键词: 苹果园 DNA提取 DGGE 施氮水平
分类号: S661.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

土壤微生物参与生物化学循环过程,并蕴藏着丰富的资源。本试验主要运用不依赖培养的微生物分子生态学方法,克服传统培养方法的局限性,直接提取土壤微生物DNA,以基因组的多样性来反应物种的多样性,从而可以全面客观发现土壤微生物的组成和多样性。本试验的主要内容是要从环境中准确的提取高质量、具有代表性的总DNA。以渭北地区优质高产苹果园的土壤为研究对象,利用四类典型的土壤优化渭北地区土壤微生物DNA提取方法。分别比较9种手动提取土壤微生物DNA的方法,包含直接提取方法、间接提取方法和试剂盒方法。在高盐SDS方法中,对提取液pH和裂解酶进行优化。利用改良的方法对不同空间层次的土壤微生物群落结构特征进行研究,最后对不同施氮水平苹果叶片特征和土壤微生物种群结构变化之间的关系进行简单的探讨。用PCR扩增16SrRNA的V3区片段检测方法的准确性。结果是利用水平检测PCR扩增DNA特异片段进行DGGE,DGGE体系最终确定为:60℃条件下,利用8%的丙烯酰胺/甲叉(37.5:1)变性浓度在30%-70%的胶,150V电泳7h。9种提取方法得到的DNA片段都是大于23kb的,最重要的是各个方法均具有较高的条带多样性。其中,间接提取方法得到的土壤微生物基因组DNA质量高于直接提取,但产率较低。针对腐植酸含量不大(有机质含量较小)的土壤,间接提取方法可以不用纯化直接运用在后续的PCR。DGGE在评价土壤微生物群落结构方面是一种非常有效的工具。提取液的pH值和脱腐缓冲液的pH值对土壤微生物DNA质量影响比较大。对于渭北地区碱性土壤,提取液pH值在9时质量最高,脱腐缓冲液pH值为10时纯度最高。裂解土壤微生物时,加入蛋白酶K得到片段较大,得到的种群结构比较完整。通过对树盘,树冠周围及行间的果园土壤微生物空间分布进行比较,发现在树盘(距主干50cm左右)处表层0~10cm深度的土壤微生物最为丰富,随着深度的变化,微生物总量减少,种群种类和多样性差异变小。施氮水平影响土壤微生物群落结构变化,并与苹果叶片全氮含量变化一致。配施氮肥的土壤微生物种群类型最为丰富,其土壤微生物种类与数量变化和果树生长状况呈正相关。氮肥水平高于一定浓度会抑制某些细菌的生长。本实验结果表明氮肥管理对土壤微生物和果树生长都有显著影响,并在一些时期存在相似性。

全文目录

摘要  5-6
ABSTRACT  6-10
第一章文献综述  10-18
  1.1 分子生态学方法研究土壤微生物的研究进展  10-14
    1.1.1 分子生态学方法研究土壤微生物的起源  10
    1.1.2 分子生态学研究土壤微生物基本内容  10-12
    1.1.3 土壤微生物DNA 提取方法研究进展  12-13
    1.1.4 DGGE 在土壤微生物研究的应用现状  13-14
  1.2 果园土壤微生物的研究进展  14-16
    1.2.1 果园土壤微生物多样性的研究内容  14-15
    1.2.2 果园土壤微生物群落研究现状  15
    1.2.3 氮肥施用对果园土壤微生物的影响  15-16
  1.3 本文研究背景、目的意义和主要内容  16-18
第二章渭北地区土壤微生物DNA 提取初步探索  18-27
  2.1 引言  18
    2.1.1 试验内容  18
    2.1.2 试验材料仪器  18
  2.2 方法  18-21
    2.2.1 材料采集和处理  18-19
    2.2.2 DNA 提取  19-21
    2.2.3 OD 值测定  21
    2.2.4 水平检测  21
    2.2.5 特异片段扩增和DGGE  21
  2.3 结果与分析  21-24
    2.3.1 DNA 质量水平检测  21-22
    2.3.2 0D 值测定结果  22
    2.3.3 提取的DNA 质量比较  22-24
  2.4 讨论  24-25
  2.5 小结  25-27
第三章土壤微生物细菌群落结构方法优化  27-33
  3.1 引言  27
    3.1.1 实验内容  27
    3.1.2 实验材料和仪器  27
  3.2 方法  27-28
    3.2.1 DNA 提取  27-28
    3.2.2 PCR  28
    3.2.3 检测  28
  3.3 结果与分析  28-30
    3.3.1 影响因素  28-30
    3.3.2 PCR  30
  3.4 讨论  30-32
  3.5 小结  32-33
第四章不同施氮水平下苹果叶片和微生物种群结构的响应  33-38
  4.1 引言  33
    4.1.1 试验内容  33
    4.1.2 实验材料和仪器  33
  4.2 方法  33-34
    4.2.1 不同施氮条件下土壤微生物群落结构的研究  33-34
    4.2.2 苹果叶片全氮含量测定和叶片叶绿素含量测定  34
  4.3 结果与分析  34-36
    4.3.1 土壤微生物群落结构特征  34-35
    4.3.2 不同施氮水平苹果叶片叶绿素含量和全氮含量的变化  35-36
  4.4 讨论  36-37
    4.4.1 土壤微生物总量的变化  36-37
    4.4.2 苹果叶片叶绿素和全氮变化  37
    4.4.3 PCR-DGGE 技术  37
  4.5 小结  37-38
第五章结论  38-39
  5.1 DNA 提取  38
  5.2 DGGE 技术  38
  5.3 氮肥施用  38-39
参考文献  39-45
附录 1  45-46
附录 2  46-48
致谢  48-49
作者简介  49
在读期间发表论文  49

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