免疫球蛋白检测方面尚无通用的试剂。为了制备出广识别谱的鱼类免疫球蛋白检测试剂,采用20株针对鳜、大黄鱼、石斑鱼、鳗鲡等鱼类血清免疫球蛋白的单克隆抗体,对大黄鱼、青石斑鱼、斜带髭鲷、美国红鱼、褐菖鮋、鳜、加州鲈等2" />

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多种鱼类血清Ig广谱型单克隆抗体的筛选与分析

作　者: 王希龙
导　师: 林天龙
学　校: 福建师范大学
专　业: 发育生物学
关键词: 经济鱼类单克隆抗体免疫球蛋白结构依赖性位点免疫
分类号: S941
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

鱼类品种繁多,亲缘距离大,在鱼类免疫球蛋白的学位论文">免疫球蛋白检测方面尚无通用的试剂。为了制备出广识别谱的鱼类免疫球蛋白检测试剂,采用20株针对鳜、大黄鱼、石斑鱼、鳗鲡等鱼类血清免疫球蛋白的单克隆抗体,对大黄鱼、青石斑鱼、斜带髭鲷、美国红鱼、褐菖鮋、鳜、加州鲈等26种常见经济鱼类的血清免疫球蛋白进行了系统的分析,试图筛选出广识别谱的单克隆抗体或单克隆抗体组合。一、鱼类的血清采集及其血清总蛋白分析。通过尾静脉窦采集了大黄鱼、青石斑鱼、斜带髭鲷、美国红鱼、褐菖触、鳜、加州鲈等26种常见经济鱼类的血清；通过Bradford方法测定血清总蛋白浓度。结果表明：这26种鱼类血清总蛋白浓度在9.00mg·ml-1～50 mg·ml-1之间,同种鱼不同个体之间血清蛋白总浓度的标准偏差都在1.90以上,存在明显差异；不同科目之间鱼血清蛋白浓度之间也存在很大的差异。二、免疫球蛋白的提取及其纯度与活性的分析。分别采用优球蛋白法与饱和硫酸铵分步盐析法纯化各种供试鱼类的血清免疫球蛋白,分别应用SDS-PAGE、ELISA、Western-blot等方法分析提取物的纯度和活性。实验结果证实优球蛋白法的提取效果显然优于饱和硫酸铵分步盐析法；以欧洲鳗鲡血清免疫球蛋白的提取结果为例：优球蛋白法纯化的欧鳗血清免疫球蛋白仅出现清晰的重轻链两个条带,纯度高于饱和硫酸铵提取的免疫球蛋白,ELISA和Western-blot结果也证实优球蛋白法纯化的免疫球蛋白活性高于饱和硫酸铵提纯的免疫球蛋白。结果提示优球蛋白法可以作为一种提取鱼类血清Ig的方法,且具有快速、简单、高效的特点。三、鱼类血清Ig共同抗原表位分析。选用20株针对鳜、大黄鱼、石斑鱼、鳗鲡血清免疫球蛋白的单克隆抗体,与26种常见经济鱼类血清免疫球蛋白进行交叉反应,从中筛选出广识别谱的单克隆抗体。ELISA分析结果显示：20种鳜、大黄鱼、石斑鱼、鳗鲡等鱼类血清免疫球蛋白的单克隆抗体对大黄鱼、青石斑鱼、斜带髭鲷、美国红鱼、褐菖触、鳜、加州鲈等26种经济鱼类血清免疫球蛋白交叉反应存在差异。构建了这些单克隆抗体与26种经济鱼类血清免疫球蛋白反应交叉谱。其中单抗2H5F4识别谱最广,能够识别大黄鱼、鳜鱼、加州鲈鱼、卵形鲳鲹、尼罗罗非鱼、花鲈、红罗非、青石斑鱼、斜带髭鲷、美国红鱼、黑鲷、鲤鱼、黑脊倒刺鲃、平胸鲂、白鲫鱼、大菱鲆、褐菖触18种供试鱼的血清免疫球蛋白；欧鳗Ig单克隆抗体7E2可以与欧洲鳗鲡、鳜鱼、鲤鱼、翘嘴红鲌、平胸鲂、白鲫鱼、海鳗、斑点叉尾鯝、黄颡鱼、革胡子鲶、鲶鱼发生交叉反应,将单抗2H5F4与单抗7E2等比例混合后能够与所采集的除牙鲆外的25种鱼类血清免疫球蛋白发生反应。这两种单抗可以作为制备鱼类免疫球蛋白广谱检测试剂的优良备选抗体。四、免疫球蛋白抗原位点及其反应特性分析。利用筛选到的广谱型单克隆抗体7F12F6、2H5F4对多种鱼类血清Ig的共同抗原表位进行了初步研究。其中单抗7F12F6可以识别同为鲈形目的鳜鱼、加州鲈鱼、花鲈、大黄鱼、美国红鱼、黑鲷六种鱼的轻链,表明这六种鱼的血清工g具有相同或相似的抗原表位。单抗2H5F4识别鱼类免疫球蛋白的重链,在变性还原条件下的蛋白印迹显示该单抗仅与大黄鱼、青石斑鱼、斜带髭鲷、美国红鱼、褐菖触等五种鱼免疫球蛋白的重链发生反应,在非变性非还原条件还能识别鳜、加州鲈鱼、卵形鲳鲹、尼罗罗非鱼、花鲈、红罗非鱼、美国红鱼、黑鲷、大菱鲆、鲤鱼、黑脊倒刺鲃、平胸鲂、白鲫鱼、褐菖触等另外13种供试鱼的免疫球蛋白。上述研究结果提示：不同鱼类免疫球蛋白之间存在共同抗原位点,单抗2H5F4所识别的抗原位点在大黄鱼、青石斑鱼、斜带髭鲷、美国红鱼、褐菖触等5种鱼中表现为非结构依赖性位点,其反应特性不受变性剂的影响,而在其余13种鱼中则表现为结构依赖性位点,且在变性条件下失去反应活性。五、单克隆抗体反应特异性验证。应用单抗2H5F4测定免疫与非免疫尼罗罗非鱼、鲤鱼血清特异性抗体水平,免疫组与非免疫组尼罗罗非鱼特异性抗体水平OD490为0.821、0.018；免疫组与非免疫组鲤鱼特异性抗体水平OD490为0.282、0.070。试验结果表明免疫组检测到了较高的抗体水平,该单抗可以应用于尼罗罗非鱼、鲤鱼的免疫检测当中。针对多种鱼类血清Ig的广谱型单克隆抗体的筛选与分析,开发广识别谱的鱼类免疫球蛋白检测试剂,将对鱼类免疫学的发展起到重要的推进作用。

全文目录

中文摘要  2-4
Abstract  4-7
中文文摘  7-9
目录  9-14
绪论  14-32
  1.1 鱼类的免疫系统  14-19
  1.2 鱼类免疫球蛋白的研究进展  19-27
  1.3 单克隆抗体技术在水产养殖中的应用  27-30
  1.4 本研究的目的意义  30-32
第一章鱼类血清的采集及其蛋白浓度测定  32-38
  1.1 前言  32
  1.2 材料  32-33
  1.3 方法  33-34
    1.3.1 血清制备  33-34
    1.3.2 蛋白浓度测定  34
  1.4 结果  34-36
    1.4.1 所采集鱼类血清蛋白浓度  34-35
    1.4.2 不同鱼种之间血清总蛋白浓度之间比较  35-36
  1.5 讨论  36-38
第二章鱼类血清Ig的纯化  38-48
  第一节优球蛋白法纯化欧鳗Ig方法的建立  38-43
    2.1 前言  38
    2.2 材料  38
    2.3 方法  38-39
      2.3.1 欧洲鳗血清的制备  38
      2.3.2 优球蛋白法纯化欧洲鳗鲡免疫球蛋白  38
      2.3.3 饱和硫酸铵分步盐析法纯化欧鳗血清  38-39
      2.3.4 蛋白浓度的测定  39
      2.3.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析  39
      2.3.6 免疫印迹实验(Western-blot Analysis)  39
      2.3.7 酶联免疫吸附反应(ELISA)  39
    2.4 结果  39-41
      2.4.1 优球蛋白纯化法与饱和硫酸铵分步盐析法纯度比较分析  39-40
      2.4.2 Western-blot分析结果  40-41
      2.4.3 ELISA检测抗体活性结果  41
    2.5. 讨论  41-43
  第二节两种方法对鱼类血清免疫球蛋白的纯化  43-48
    2.1 前言  43
    2.2 材料  43
    2.3 方法  43
      2.3.1 饱和硫酸铵分步盐析法纯化26种经济鱼类血清  43
      2.3.2 优球蛋白法纯化26种经济鱼类血清  43
      2.3.3 血清蛋白浓度的测定  43
      2.3.4 变性还原条件下的聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)  43
    2.4 结果  43-45
      2.4.1 两种方法纯化的鱼类血清Ig蛋白总浓度比较  43-44
      2.4.2 两种纯化方法的SDS-PAGE图谱比较分析  44-45
    2.5 讨论  45-48
第三章 26种鱼类Ig共同抗原位点分析  48-56
  3.1 前言  48
  3.2 材料  48-49
    3.2.1 鳜、大黄鱼、石斑鱼、鳗鲡血清Ig的单克隆抗体  48-49
    3.2.2 二十六种经济鱼类血清  49
  3.3 方法  49-50
    3.3.1 血清Ig纯化  49
    3.3.2 单抗腹水的制备  49-50
    3.3.3 单抗交叉谱构建  50
  3.4 结果  50-54
    3.4.1 鳜单克隆抗体与26种经济鱼类Ig交叉反应谱  50-52
    3.4.2 大黄鱼、石斑鱼单克隆抗体与26种鱼类Ig交叉反应谱  52-53
    3.4.3 鳗鲡单克隆抗体与26种鱼类Ig的反应交叉谱  53-54
  3.5 讨论  54-56
第四章广谱单抗及其组合应用研究  56-64
  4.1 前言  56
  4.2 材料  56
    4.2.1 单克隆抗体  56
    4.2.2 两种方法纯化的鱼类血清Ig  56
  4.3 方法  56-57
    4.3.1 单抗2H5F4分析两种方法纯化鱼类血清Ig效果  56
    4.3.2 单抗8D6分析两种方法纯化鱼类血清Ig效果  56
    4.3.3 单抗混合实验  56-57
    4.3.4 单抗2H5F4、7F12F6效价测定  57
    4.3.5 单抗2H5F4、7F12F6灵敏度测定  57
  4.4 结果  57-61
    4.4.1 单抗2H5F4分析两种方法纯化鱼类血清Ig效果  57-58
    4.4.2 单抗8D6分析两种方法纯化鱼类血清Ig效果  58-59
    4.4.3 单抗混合实验结果  59-60
    4.4.4 鳜鱼单抗7F12F6对多种鱼类Ig的效价、灵敏性结果  60
    4.4.5 单克隆抗体2H5F4效价与灵敏度  60-61
  4.5 讨论  61-64
第五章单抗7F12F6对多种鱼类Ig表位的研究  64-72
  5.1 前言  64
  5.2 材料  64
    5.2.1 鳜鱼血清免疫球蛋白的单克隆抗体7F12F6  64
    5.2.2 实验鱼血清  64
  5.3  64-65
    5.3.1 鱼类血清免疫球蛋白的纯化  64
    5.3.2 纯化血清蛋白浓度的测定  64
    5.3.3 ELISA与斑点ELISA实验  64-65
    5.3.4 变性条件下的凝胶电泳及其蛋白印迹实验  65
    5.3.5 非变性非还原条件下的凝胶电泳及其蛋白印迹实验  65
  5.4. 结果  65-69
    5.4.1 ELISA与斑点ELISA实验结果比较  65-67
    5.4.2 纯化血清效果比较  67
    5.4.3 变性条件下的蛋白印迹实验  67-68
    5.4.4 非变性非还原条件下的蛋白印迹实验  68-69
  5.5 讨论  69-72
第六章单抗2H5F4对鱼类Ig表位的研究及特异性验证  72-82
  6.1 前言  72
  6.2 材料  72
  6.3 方法  72-74
    6.3.1 间接ELISA检测单抗2H5F4与26种经济鱼类反应情况  72
    6.3.2 SDS-PAGE及其蛋白印迹实验(Western-blot)  72
    6.3.3 非变性非还原条件下的凝胶电泳及其蛋白印迹实验  72-73
    6.3.4 嗜水气单胞菌ZN1外膜蛋白制备  73
    6.3.5 嗜水气单胞菌外膜蛋白免疫刺激复合物(ISCOMs)制备  73
    6.3.6 尼罗罗非鱼免疫试验  73
    6.3.7 鲤鱼免疫实验  73-74
  6.4 结果  74-79
    6.4.1 ELISA检测单抗2H5F4与多种经济鱼类的反应  74-75
    6.4.2 变性还原条件下的凝胶电泳及其蛋白印迹实验  75-76
    6.4.4 非变性非还原条件下的凝胶电泳及其蛋白印迹实验  76-78
    6.4.5 尼罗罗非鱼免疫试验  78
    6.4.6 鲤鱼免疫实验  78-79
  6.5 讨论  79-82
结论  82-84
附录  84-88
参考文献  88-96
攻读学位期间承担的科研任务与主要成果  96-98
致谢  98-100
个人简历  100-101

多种鱼类血清Ig广谱型单克隆抗体的筛选与分析

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