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白首乌总苷A（CGA）酸水解产物的抗肿瘤作用研究

作　者: 徐佳丽
导　师: 张如松
学　校: 浙江中医药大学
专　业: 药学
关键词: 白首乌 MTT法体外抗肿瘤作用结构解析
分类号: R285
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的分离纯化出白首乌总苷A(CGA)酸水解后的甾体苷类成分,研究其体外抗肿瘤作用,解析其化学结构,为进一步将其研究开发成抗肿瘤新药提供科学依据。方法①酸水解产物的分离纯化：利用1%o盐酸对白首乌总苷A进行水解,水解产物经硅胶柱层析分离得到极性不同的流分,各流分经反复硅胶柱层析和高效液相柱层析进一步纯化,以期得到单体化合物。②酸水解产物的体外抗肿瘤作用研究：MTT法测定酸水解产物对人前列腺癌细胞PC3,人胃癌细胞SGC-7901,人宫颈癌细胞Hela,人白血病细胞NB4,人肝癌细胞HEPG-2和鼠源黑色素瘤细胞B16的IC50(半数抑制浓度),评价酸水解产物对不同肿瘤细胞的细胞毒作用及对不同肿瘤细胞的选择性；利用细胞生长曲线观察水解产物对肿瘤细胞抑制作用的时-效关系和量-效关系；细胞形态学观察水解产物对肿瘤细胞株形态的影响；采用免疫荧光染色法和流式细胞术检测水解产物诱导肿瘤细胞株凋亡的作用,初步探讨水解产物抗肿瘤作用的作用机制。③酸水解产物的结构鉴定：利用IR,HR-ESI-MS,1H NMR,13C NMR,DEPT,HMBC和HMQC等现代波谱技术解析酸水解产物的化学结构。结果①通过现代色谱技术对CGA酸水解产物分离纯化,得到2个水解产物,即：化合物Ⅰ和化合物Ⅱ。②MTT法试验结果显示：化合物Ⅰ和化合物Ⅱ在体外对多种肿瘤细胞株均具有一定程度的细胞毒作用,并存在剂量和时间依赖关系。化合物Ⅰ对六种肿瘤细胞株的IC50依次为：PC3:8.5μg/ml,SGC-7901:29.4μg/ml,Hela: 27.7μg/ml,NB4:8.9μg/ml,HEPG-2:17.7μg/ml,B16:15.8μg/ml；化合物Ⅱ对六种肿瘤细胞的IC50依次为：PC3:11.7μg/ml,SGC-7901:28.5,μg/ml Hela:16.75μg/ml, NB4:10.7μg/ml,HEPG-2:19.8μg/ml,B16:9.1μg/ml.③细胞生长曲线结果显示：经不同浓度的化合物Ⅰ和化合物Ⅱ处理后的肿瘤细胞生长均受到抑制,且呈浓度和时间依赖性。PC3细胞株,当化合物浓度Ⅰ、Ⅱ给药浓度均为20.0μg/ml时,加药52,76,100,124小时后,对肿瘤细胞的抑制率分别为：20.7%,28.6%,41.7%,58.9%与22.7%,32.6%,45.4%,54.9%。SGC-7901细胞株,当化合物浓度Ⅰ、Ⅱ给药浓度均为20.0μg/ml时,加药52,76,100,124小后,对肿瘤细胞的抑制率分别为：21.5%,30.8%,40.6%,57.2%与10.82%,21.16%,36.9%,44.2%。Hela细胞株,当化合物Ⅰ、Ⅱ给药浓度均为20.0μg/ml时,加药52,76,100,124小时后,对肿瘤细胞的抑制率分别为：18.3%,25.7%,38.5%,48.3%与16.9%,28.8%,42.4%,50.3%。HEPG-2细胞株,当化合物Ⅰ、Ⅱ给药浓度均为20.0μg/ml时,加药52,76,100,124小时后,对细胞的抑制率分别为：20.3%,29.5%,40.6%,52.7%与24.7%,32.6%,48.9%,65.8%。④细胞形态学观察结果显示：经化合物Ⅰ、Ⅱ在一定浓度(80μg/ml和40μg/ml)处理3天后,给药组肿瘤细胞与正常组肿瘤细胞相比,细胞数量明显降低,贴壁细胞变圆变小,部分悬浮,细胞膜皱缩,细胞碎片增多。⑤免疫荧光显色结果显示：染色后显微镜下,正常对照组细胞细胞膜完整,核形态均一边聚,核内染色均匀一致；经化合物Ⅰ、Ⅱ在一定浓度(80μg/ml和10μg/ml)下处理后转染的PC3细胞,体积缩小,膜皱缩,核凝聚变小,染色较深,染色质浓聚,荧光增强,碎裂成大小不等的碎片。⑥流式细胞术检测结果显示：在24h内,与正常PC3细胞相比,经化合物Ⅰ、Ⅱ在一定浓度下(80μg/ml和40μg/ml)处理后,PC3细胞的凋亡率明显高于正常对照组细胞,而且凋亡率有一定的浓度依赖性,在一定时间范围内,凋亡率随着给药浓度的增大而增高。⑦化合物Ⅰ和化合物Ⅱ经鉴定,化学结构分别为：告达庭苷元(caudatin),告达庭3-O-p-D-磁麻吡喃糖基-(1→4)-p-D-磁麻糖吡喃糖基-(1→4)-p-D-磁麻糖吡喃糖苷(caudatin3-O-β-D-cymarapyranosyl-(1→4)-β-D-ymarapyranosyl-(1→4)-β-D-ymarapyranoside)。结论①对白首乌苷A(CGA)酸水解后,从其水解产物中分离得到了两个甾体苷类化合物,其化学结构经鉴定为：告达庭苷元(caudatin),告达庭3-O-β-D-磁麻吡喃糖基-(1→4)-β-D-磁麻糖吡喃糖基-(1→4)-p-D-磁麻糖吡喃糖苷(caudatin3-O-β-D-cymarapyranosyl-(1→4)-β-D-ymarapyranosyl-(1→4)-β-D-ymarapyranoside)。②两个甾体苷类化合物体外对多种肿瘤细胞株具有细胞毒作用,且具有一定的诱导PC3细胞株凋亡的作用。③化合物Ⅱ为酸水解后,首次从该植物中分离得到的化合物。

全文目录

中文摘要  5-7
ABSTRACT  7-10
一、前言  10
二、材料与方法  10-15
  (一) 主要仪器设备  10-11
  (二) 主要试剂及药品  11
  (三) 实验方法  11-15
    1. CGA的制备和分离  11-12
    2. CGA流分五的水解和水解产物的分离纯化  12
    3. 水解产物Ⅰ和水解产物Ⅱ的结构分析  12-13
      (1) 水解产物Ⅰ的光谱数据  12
      (2) 水解产物Ⅱ的光谱数据  12-13
    4. 水解产物Ⅰ和水解产物Ⅱ的体外抗肿瘤试验  13-15
      (1) MTT法测定化合物IC50  13
      (2) 细胞生长曲线的测定  13-14
      (3) 细胞形态学观察  14
      (4) 水解产物诱导PC3肿瘤细胞凋亡机制的研究  14-15
三、结果  15-21
  (一) CGA的制备和分离  15
  (二) CGA流分水解产物的制备和分离  15
  (三) 光谱分析  15-17
    1. 水解产物Ⅰ结合光谱的结构解析  15
    2. 水解产物Ⅱ结合光谱的结构解析  15-17
  (四) 水解产物的体外抗肿瘤作用研究  17-21
    1. MTT法测定水解产物的体外抗肿瘤作用  17-18
    2. 细胞生长曲线法测定水解产物对肿瘤细胞的影响  18-19
    3. 形态学观察水解产物对肿瘤细胞的抑制作用  19-20
    4. 肿瘤细胞增值抑制机制的研究结果  20-21
四、分析与讨论  21-22
  (一) CGA水解的意义  21
  (二) 两种水解产物的体外抗肿瘤作用  21-22
  (三) 两种水解产物体外抗肿瘤作用机制研究  22
五、结论  22-27
图片  27-42
参考文献  42-44
文献综述  44-62
  参考文献  59-62
致谢  62

白首乌总苷A（CGA）酸水解产物的抗肿瘤作用研究

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