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小豆蔻明靶向作用于mTOR抑制血管平滑肌细胞增殖的研究

作　者: 郑炜
导　师: 史道华
学　校: 福建中医学院
专　业: 中药学
关键词: 小豆蔻明 胰岛素抵抗 血管平滑肌细胞 细胞增殖 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 细胞培养技术
分类号: R285.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


[研究背景及目的]胰岛素抵抗（Insulin Resistance,IR）是糖尿病、高血压、动脉粥样硬化等疾病的共同病理生理基础,常引起中央或外周血管结构和功能的改变,导致血管张力的异常增加以及血管平滑肌细胞（Vascular Smooth Muscular Cells,VSMCs）的异常增殖。因此,改善IR,逆转或抑制VSMCs增殖是防治血管增殖性疾病的重要措施。哺乳类雷帕霉素靶蛋白（Mammalian Target Of Rapamycin,mTOR）为胰岛素（Insulin,Ins）信号通路中的重要分子,参与基因转录、蛋白质起始翻译、核糖体生物合成及细胞增殖等多种生物学效应,是细胞生长过程中极为重要的靶标。研究表明,血管增殖性疾病、代谢综合症等诸多疾病的发生发展均与mTOR的表达及功能改变有关。常用的抗排斥药物雷帕霉素（Rapamycin,RAP）为mTOR特异性抑制剂,能够抑制VSMCs增殖,提示mTOR可能成为防治血管增殖性病变的重要靶标。然而,RAP主要用于抗移植排异,不良反应较多,限制全身性应用。中药资源丰富,基于mTOR筛选抑制抗增殖的中药有效成分的研究,国内外少见。因此,以mTOR为靶标改善IR所致血管病变的药物研发具有广阔前景。小豆蔻明（Cardamonin,Car）为豆蔻属植物中的查尔酮类单体,化学结构为2,4-双羟基-6’甲氧基查尔酮。研究显示,Car具有心血管保护作用,能明显舒张血管。目前,Car在IR状态下对VSMCs增殖影响的研究国内外少有报道。本研究以高糖高胰岛素模拟IR状态培养人脐动脉平滑肌细胞（Human Umbilical Artery Smooth Muscle Cells,HUASMCs）,探讨Car对高糖高胰岛素诱导HUASMCs增殖的影响,通过检测mTOR及其结合蛋白Raptor、Rictor的mRNA表达,深入探讨Car抑制细胞增殖的作用机制,同时考察Car免疫抑制活性,为寻找改善IR、治疗血管增殖性病变的药物提供实验基础。[方法]1.细胞培养采用组织贴块法培养原代HUASMCs,传代细胞分別川含10%小牛血清的正常RPMI 1640培养基和高糖高胰岛素模拟IR培养基(含2.5 mol·L-1葡萄糖和100 U·L-1胰岛素的RPMI 1640培养基)在37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。采用密度梯度离心法分离健康人外周血淋巴细胞。淋巴细胞用含10%小牛血清的正常RPMI 1640培养基,在37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。2.分组与给药HUASMCs按正常培养和模拟IR培养后,分别设细胞对照组、PD98059（?）3×10-5MOL·L-1)组、PD98059+LY294002(10-5 mol·L-1)组、PD98059+LY294002+PA(10-4mol·L-1)组、RAP(10-7 mol·L-1)组及Car(10-8 mol·L-1、10-7 mol·L-1、10-6 mol·L-1、10-5mol·L-1、10-4 mol·L-1)组。人淋巴细胞按正常培养及PHA(5 mg·L-1)刺激培养后,设细胞对照组、PHA组、阳性药物RAP及CsA(10-7 mol·L-1、10-5 mol·L-1)对照组、Car(10-7 mol·L-1、3×10-7 mol·L-1、10-6 mol·L-1、3×10-6 mol·L-1、10-5 mol·L-1、3×10-5 mol·L-1、10-4 mol·L-1)组。3.测定指标经不同试药处理3 d,用不含细胞的培养基空白孔调零,MTT法（λ=490 nm）测定HUASMCs增殖。采用ELISA法测定人淋巴细胞分泌的IL-2水平。利用Trizol试剂,一步法提取HUASMCs总RNA,经Real-time PCR扩增mTOR、Raptor和Rictor,以β-actin作内参,采用Livak法计算mRNA表达量。[结果]1.高糖高胰岛素培养基较正常培养基明显促进HUASMCs的增殖（0.545±0.028 vs0.422±0.047,P＜0.01）。对于正常及模拟IR培养的HUASMCs,10-8 mol·L-1、10-7 mol·L-1、10-6 mol·L-1 Car对细胞增殖无影响,高剂量Car(10-5 mol·L-1、10-4 mol·L-1)抑制细胞增殖（P＜0.01）。PD98059抑制HUASMCs增殖,RAP及Car(10-4 mol·L-1)能加强该作用（P＜0.05,P＜0.01）。同时加入PD98059及LY294002,并进一步采用PA诱导HUASMCs增殖,该作用可被RAP及高低剂量Car(10-6 mol·L-1、10-4 mol·L-1)所阻断（P＜0.05,P＜0.01）,且高剂量Car作用较RAP对照更为显著（P＜0.01）。2.预先给予PD98059,RAP及Car(10-6 mol·L-1、10-5 mol·L-1)能明显降低正常培养及模拟IR状态下HUASMCs中mTOR mRNA的表达。RAP、Car(10-6 mol·L-1、10-5 mol·L-1)对正常培养的HUASMCs中Raptor mRNA的表达均具有抑制作用。对于模拟IR培养的HUASMCs,RAP、Car(10-5 mol·L-1)则呈促进作用。在正常培养状态下,RAP对HUASMCs中Rictor mRNA的表达具有抑制作用,Car(10-6 mol·L-1、10-5 mol·L-1)作用相反,表现为促进表达;在模拟IR状态下,RAP、Car(10-5 mol·L-1)均对Rictor mRNA的表达呈促进作用。同时加入PD98059及LY294002,PA可明显促进HUASMCs中mTOR mRNA的表达,且RAP、Car(10-5 mol·L-1)可抑制该作用,Car(10-6 mol·L-1)对mTOR mRNA的表达无影响。在两种培养模式下,使用PD98059和LY294002后,Raptor及Rictor mRNA的含量显著降低。利用PA刺激,二者mRNA表达显著增加。RAP对正常培养状态下Raptor及Rictor mRNA的表达具有促进作用,但在IR状态下则表现为相反作用。Car(10-5 mol·L-1)对二者的表达不论是在正常还是模拟IR状态下,均呈现抑制作用。3.PHA可增加人淋巴细胞活性,促进IL-2分泌（10.400±0.582 vs 15.575±0.794,P＜0.01）,Car对正常培养及PHA诱导的淋巴细胞活性呈现浓度依赖性,Car(10-5 mol·L-1、3×10-5 mol·L-1)不明显影响IL-2分泌。[结论]低剂量Car对血清诱导正常及模拟IR状态培养的HUASMCs无影响,而高剂量抑制增殖。在模拟胰岛素抵抗状态下,利用PD98059和LY294002干预后,Car(10-5 mol·L-1)对PA诱导的增殖具有抑制作用,可降低mTOR mRNA的表达,同时减少Raptor和RictormRNA的含量,推测Car抑制细胞增殖机制与mTOR通路密切相关,可能直接或主要作用于mTOR。同时,Car不明显影响人淋巴细胞IL-2的分泌,提示Car对机体的免疫抑制较小。Car有望开发成为影响mTOR且免疫抑制作用较小的新型细胞增殖抑制剂。

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药药理学 > 中药实验药理
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