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热带爪蟾Dmrt5在早期胚胎发育中的功能研究

作　者: 陆怡
导　师: 黄晓
学　校: 浙江大学
专　业: 发育生物学
关键词: 热带爪蟾 Dmrt5 嗅觉神经形成
分类号: Q954.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

DMRT/Dmrt (Doublesex and Mab3 Related Transcription factor)是一类与果蝇的性别发育调控因子Doulesex以及线虫性别发育调控因子Mab-3相关的转录因子,它们共同的特征就是具有一个类似锌指的、富含半胱氨酸、能和特异DNA序列结合的结构基序——DM保守域。目前已发现的8种DMRT/Dmrt基因,DMRT/Dmrt的大部分成员都在性腺中表达,这表明它们可能参与了性别分化或决定,此外,部分DMRT/Dmrt成员还参与胚胎发育的其他过程,如体节的发育以及神经的生成。因此Dmrt基因家族是一类非常重要的与发育相关的基因,具有重要的研究意义。我们以前的研究发现爪蟾Dmrt4在嗅觉原基和前脑中表达并在嗅觉神经的形成过程中发挥着重要作用,然而在实施基因敲落的实验中发现其效率较低,因此我们推测可能有其他的Dmrt同源基因在嗅觉神经形成的过程中存在着功能冗余。本研究通过对热带爪蟾Dmrt5的克隆以及其在胚胎发育过程中的时空表达和功能分析,来探讨Dmrt5是否存在与Dmrt4类似的参与嗅觉神经形成的重要功能。主要的研究结果如下：1.运用RT-PCR从热带爪蟾(X.tropicalis)胚胎中克隆得到Dmrt5全长cDNA,构建系统进化树,从而确认所得到的克隆是Dmrt5基因。2.通过RT-PCR和整体原位杂交方法表明Dmrt5可能是一种母系因子(maternal factor),从胚胎的神经胚早期开始,Dmrt5主要在神经板头部边缘特异表达,到神经胚晚期,Dmrt5的表达则主要集中在形成中的嗅觉原基和端脑背部以及中脑腹部。3. Dmrt5受到fgf, RA, wnt这些尾部化因子的抑制,符合神经形成诱导的假说。4.通过功能丧失性实验(显性抑制突变体和morpholino),发现Dmrt5基因敲落可以抑制神经分子标记信号因子Neurogenin和嗅觉的神经元分化因子Xebf2的表达。5.在基因敲落的试验中,我们中还发现Dmrt5的基因敲落可以抑制Dmrt4的表达。从以上研究结果我们推测热带爪蟾Dmrt5能够与Dmrt4一样调控嗅觉神经形成下游基因Neurogenin和Xebf2的表达,因而在嗅觉神经形成过程中起着重要的调节作用,并且这种调控可能是通过对Dmrt4的表达的调控来实现的。

全文目录

致谢  4-5
中文摘要  5-6
ABSTRACT  6-10
第一章前言  10-21
  1.1. DMRT基因的相关综述  10-17
    1.1.1. Dmrt基因的表达  10-13
    1.1.2. Dmrt基因的功能  13-17
      1.1.2.1. Dmrt1  13-14
      1.1.2.2. Dmrt2  14-15
      1.1.2.3. Dmrt3  15
      1.1.2.4. Dmrt4  15-16
      1.1.2.5. Dmrt5  16
      1.1.2.6. Dmrt7  16-17
  1.2. 热带爪蟾作为研究模式动物的优势  17-18
  1.3. 本研究的内容、目的和意义  18-21
第二章实验材料与方法  21-36
  2.1. 实验材料  21-25
    2.1.1. 实验模式动物  21
    2.1.2. 实验有关的试剂盒  21
    2.1.3. 实验相关试剂  21-22
    2.1.4. 实验相关溶液的配置  22-25
  2.2. 实验方法  25-36
    2.2.1. 引物设计  25
    2.2.2. 爪蟾胚胎的获取  25
    2.2.3. 胚胎总RNA抽提  25-26
    2.2.4. RNA逆转录-第一链cDNA的合成  26
    2.2.5. PCR反应体系  26-27
    2.2.6. PCR产物的割胶回收  27
    2.2.7. 载体连接反应T载体  27-28
    2.2.8. E.coli TG1感受态细胞的制备  28
    2.2.9. 转化  28-29
    2.2.10. 质粒的抽提  29
    2.2.11. 酶切鉴定  29-30
    2.2.12. 探针的制备  30-31
      2.2.12.1. 模板的制备  30
      2.2.12.2. 探针的合成  30
      2.2.12.3 探针的纯化  30-31
    2.2.13. 胚胎的整体原位杂交  31-32
      2.2.13.1. 原位杂交第一天  31
      2.2.13.2. 原位杂交第二天  31-32
      2.2.13.3. 原位杂交第三天  32
      2.2.13.4. 原位杂家第四天  32
      2.2.13.5. 原位杂交第五天  32
    2.2.14. 石蜡切片  32-34
    2.2.15. RNA的合成  34
      2.2.15.1. 模板的制备  34
      2.2.15.2. 正义RNA的合成  34
      2.2.15.3. RNA纯化  34
    2.2.16. 胚胎的显微注射  34-36
第三章实验结果与分析  36-63
  3.1. DMRT5基因的克隆和序列分析  36-39
    3.1.1. Dmrt5全长cDNA的克隆  36-37
    3.1.2. Dmrt5基因的序列进化树分析及蛋白序列比对  37-39
  3.2. DMRT5在胚胎的嗅觉系统和端脑中表达  39-43
  3.3. DMRT5的表达可被RA,FGF,WNT-3A等尾部化信号因子所抑制  43-46
    3.3.1. RA信号可抑制Dmrt5基因的表达  43-44
    3.3.2. Fgf信号可抑制Dmrt5基因的表达  44-45
    3.3.3. Wnt-3a可抑制Dmrt5基因的表达  45-46
  3.3. 嗅觉原基中XEBF2和NEUROGENIN的表达需要DMRT5  46-59
    3.4.1. Dmrt5功能获得的研究  46-48
      3.4.1.1. Dmrt5功能获得对Bf1基因的表达基本没有影响  47-48
    3.4.2. Dmrt5功能丧失的研究  48-59
      3.4.2.1. Dmrt5显性抑制突变体对Dmrt5基因的敲落  48-52
        3.4.2.1.1 Dmrt5显性抑制突变体的构建  48-49
        3.4.2.1.2. Dmrt5显性抑制突变体可以抑制ebf2基因的表达  49-50
        3.4.2.1.3. Dmrt5显性抑制突变体可以抑制neurogenin基因的表达  50-51
        3.4.2.1.4. Dmrt5显性抑制突变体对Bf1表达基本没有影响  51-52
      3.4.2.2. MO注射对Dmrt5基因的敲落  52-59
        3.4.2.2.1 Dmrt5 ATG-MO可以抑制胚胎头部发育  53-55
        3.4.2.2.2. Dmrt5 ATG-MO可以抑制胚胎neurogenin的表达  55-56
        3.4.2.2.3. Dmrt5 MOs可以抑制ebf2基因的表达  56-57
        3.4.2.2.4. Dmrt5 MOs可以抑制neurogenin基因的表达  57-59
  3.5. DMRT5和DMRT4之间的具有一定的相互调控关系  59-63
    3.5.1. 显性抑制突变体Dmrt5可以抑制Dmrt4基因的表达  59-60
    3.5.2. Dmrt5 MOs可以抑制Dmrt4的表达  60-63
第四章讨论  63-68
参考文献  68-74
作者简历  74

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中图分类: > 生物科学 > 动物学 > 动物形态学 > 动物胚胎学（动物发生学、动物胎生学）
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