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实时多重荧光PCR快速鉴别布鲁菌方法的建立

作　者: 刘志国
导　师: 侯勇跃；崔步云
学　校: 内蒙古农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 布鲁菌 实时多重PCR 菌株鉴别
分类号: S855.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 141次
引　用: 2次
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内容摘要


应用实时多重荧光PCR技术建立快速鉴别布鲁菌的方法。以布鲁菌特异性基因BCSP31,ALKB/IS711和BMEII1162/IS711的部分保守片段作为靶基因,分别设计探针引物以及建立多重荧光PCR扩增体系。应用实时多重荧光PCR技术检测布鲁菌结果显示,布鲁菌属、牛种布鲁菌和羊种布鲁菌有荧光信号,而其他生物型布鲁菌株及与其同源性较高的致病菌均未见荧光信号;将其扩增产物作为靶基因克隆到PUCm18-T载体,制备标准品及标准曲线。扩增梯度稀释的标准品以确定此方法的灵敏性。应用布鲁菌的其他生物型菌株和同源性较近的致病菌8株(汉赛巴尔通体1株、霍乱弧菌1株、土拉弗朗西斯菌1株、大肠杆菌O:157 1株、大肠杆菌O:161株、小肠结肠耶尔森菌O:9 1株、沙门氏菌N群血清型菌1株、嗜麦芽假单胞菌1株)验证试验的特异性,对97株布鲁菌提取DNA进行检测,从而达到快速鉴别布鲁菌的目的。该试验的单重,多重检测灵敏性均为7.68、7.58、7.54×102copy/μl或13～24fg/μl;而该引物的常规PCR检测灵敏性为7.68、7.58、7.54×104copy/μl或130～240pg/μl。试验能够特异的鉴别布鲁菌、牛种布鲁菌和羊种布鲁菌,同时具有敏感性高、快速易操作等优点,可用于布鲁菌的快速鉴别诊断、疾病监测以及疫情病原调查。

全文目录


摘要  3-4
Abstract  4-9
1 前言  9-24
  1.1 布鲁菌病的概述  9
  1.2 病原学  9-12
    1.2.1 布鲁菌的形态与特征  9-10
    1.2.2 布鲁菌生长及培养特性  10
    1.2.3 生物学特性  10-12
  1.3 布鲁菌致病性、致病机制及免疫性  12-13
    1.3.1 致病性  12
    1.3.2 致病机制  12-13
    1.3.3 免疫力原性  13
  1.4 流行病学及临床症状  13-15
    1.4.1 流行病学  13-14
    1.4.2 临床症状  14-15
  1.5 特异性布病实验室诊断  15-16
    1.5.1 病原学诊断  15
    1.5.2 血清学诊断  15-16
  1.6 治疗原则  16
    1.6.1 抗菌疗法  16
    1.6.2 特异性脱敏疗法  16
    1.6.3 中医中药疗法  16
  1.7 监测  16-17
    1.7.1 人间布鲁菌病的监测  17
    1.7.2 畜间布鲁菌病的监测  17
  1.8 防控措施  17-18
    1.8.1 控制传染源  17-18
    1.8.2 切断传播途径也是重要措施之一  18
    1.8.3 提高人群免疫力  18
  1.9 展望  18
  1.10 荧光定量PCR 方法的原理、方法、应用  18-24
    1.10.1 实时荧光PCR 原理  19-20
    1.10.2 荧光化学  20-22
    1.10.3 实时荧光定量 PCR 技术的应用  22-23
    1.10.4 实时荧光定量PCR 技术在布鲁菌快速检测中存在的问题及应用前景  23-24
  1.11 本研究的目的和意义  24
2 材料与方法  24-36
  2.1 材料  24-30
    2.1.1 试验菌株  24-29
    2.1.2 主要实验仪器  29
    2.1.3 试验试剂  29-30
  2.2 方法  30-36
    2.2.1 实时荧光 PCR 引物和探针的设计及合成  30-31
    2.2.2 细菌、血清染色体DNA 的提取  31
    2.2.3 实时多重荧光PCR 体系的建立  31
    2.2.4 试验参数的优化  31-32
    2.2.5 BCSP31、ALKB 和BME11162 基因的单重荧光 PCR 反应条件建立  32
    2.2.6 BCSP31、ALKB 和BME11162 基因的实时多重荧光PCR 反应建立  32
    2.2.7 试验用阳性标准品的制备及标准曲线的制作  32-35
    2.2.8 特异性检测试验  35
    2.2.9 灵敏性检测试验  35
    2.2.10 多重实时荧光PCR 在临床样本中的应用  35-36
3 试验结果  36-49
  3.1 试验参数优化结果  36-39
    3.1.1 引物浓度优化结果  36
    3.1.2 探针浓度优化结果  36-37
    3.1.3 退火温度优化结果  37-39
  3.2 标准品的制备和标准曲线的制作结果  39-42
    3.2.1 荧光PCR 扩增结果  39
    3.2.2 阳性克隆的PCR 鉴定结果  39
    3.2.3 三个基因克隆的测序结果  39-41
    3.2.4 质粒拷贝数的计算结果  41
    3.2.5 标准曲线的制作结果  41-42
  3.3 特异性检测试验结果  42-43
  3.4 灵敏性检测试验结果  43-45
    3.4.1 单重实时荧光PCR 的灵敏性检测试验结果  43-44
    3.4.2 多重实时荧光PCR 的灵敏性检测试验结果  44-45
  3.5 实时多重荧光PCR 在临床样本中的应用  45-49
4 讨论  49-52
5 结论  52-53
致谢  53-54
参考文献  54-58
作者简介  58

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医传染病学 > 细菌病
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