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稳定表达不同动物犬瘟热病毒受体SLAM的Vero细胞系的建立
作 者: 闫如勋
导 师: 陈立志;闫喜军
学 校: 江苏科技大学
专 业: 生物化学与分子生物学
关键词: 犬瘟热病毒 受体 信号淋巴细胞激活分子 Vero细胞系
分类号: S855.3
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要
犬瘟热(Canine distemper, CD)是由犬瘟热病毒(Canine distemper virus, CDV)病毒引起的一种高度接触性传染病。该病是养犬业、毛皮动物养殖业危害最大的传染病病之一,可引起大批犬、貂、狐等动物发病,发病死亡率为3080%,雪貂高达100%。病毒分离技术是对CDV特性的研究的重要手段,但具有囊膜的CDV不易在环境中存活,因此难以用普通方法分离成功,限制其对CDV的研究。信号淋巴细胞激活分子(Signaling Lymphocyte Activation Molecule, SLAM)是CDV感染宿主的主要受体,本文旨在建立稳定表达不同动物(犬、狐狸、貉和水貂)SLAM的Vero细胞系,用于CDV分离和体外研究。用PCR的方法以克隆有犬、狐狸、貉和水貂SLAM的pMD18-T (分别命名pMD18-T-cSLAM、pMD18-T-fSLAM、pMD18-T-rSLAM和pMD18-T-mSLAM)为模板扩增目的基因片段,将其定向插入到真核表达载体pIRES2-EGFP中,得到重组表达载体pIRES2-EGFP-cSLAMh、pIRES2-EGFP-fSLAMh和pIRES2-EGFP-mSLAMh。将空载体和已构建完成的重组表达载体分别用脂质体法转染到Vero细胞,通过G418和EGFP筛选稳定表达的阳性Vero细胞。用免疫组化的方法证实SLAM在传了6代转染重组质粒的细胞内的表达。成功建立了稳定表达动物(犬、狐狸、貉和水貂)SLAM的Vero细胞系,分别命名为V-p-cSLAMh、V-p-fSLAMh、V-p-rSLAMh和V-p-mSLAMh细胞系。对建立的V-p-rSLAMh细胞系进行稳定性、病毒分离敏感性和分离CDV毒力评价。6次冻存复苏的V-p-rSLAMh细胞生长良好,说明细胞稳定性良好。将V-p-rSLAMh细胞系和Vero细胞分别接种3份CD阳性样品,接种3份样品后的细胞系在接毒36~48h形成典型的细胞病变(cytopathic effect, CPE),而在Vero细胞连续盲传6代未见犬瘟热病毒典型CPE,可见建立的细胞系在分离CDV方面比Vero细胞敏感。以V-p-rSLAMh细胞系分离到的LN((10)f1株CDV进行貉和狐狸攻毒实验,每只的攻毒剂量为4×102.39 TCID50/只,攻毒组3只貉和狐狸在11~22d死亡,正常对照组貉和狐狸健康存活,说明分离的CDV LN(10)f1株具有较强毒力。H基因序列分析表明该CDV强毒属于Asia-1基因型。稳定表达SLAM的细胞系的建立为CDV的研究提供了一个有效的操作平台,同时也为CDV强毒株的获得提供保障。
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全文目录
摘要 6-7 Abstract 7-13 第1章 绪论 13-19 1.1 病原特征 13-14 1.2 犬瘟热病毒分离技术研究进展 14-17 1.2.1 原代细胞 15 1.2.2 传代细胞 15 1.2.3 稳定表达SLAM的细胞系 15-17 1.3 本课题研究的目的及内容 17-19 第2章 表达不同动物犬瘟热病毒受体SLAM的Vero细胞系的建立 19-33 2.1 材料与方法 19-26 2.1.1 质粒、菌株与细胞 19 2.1.2 主要的试剂和仪器 19-20 2.1.3 常用溶液和培养基的配置 20-21 2.1.4 PCR 扩增与基因克隆 21 2.1.5 真核表达载体的构建 21-23 2.1.6 G418最适浓度的确定 23 2.1.7 转染用高纯度质粒的制备 23-24 2.1.8 细胞转染 24 2.1.9 瞬时转染后分离病毒验证 24-25 2.1.10 稳定转染细胞的克隆筛选 25 2.1.11 稳定转染细胞系蛋白表达的验证 25 2.1.12 绘制细胞生长曲线 25-26 2.2 结果 26-31 2.2.1 目的条带的获得 26 2.2.2 真核表达载体获得及酶切鉴定 26-27 2.2.3 G418加压筛选浓度的确定 27 2.2.4 Vero细胞瞬时转染及转染后对细胞敏感性的影响 27-28 2.2.5 稳定转染的Vero细胞系的建立 28-29 2.2.6 细胞免疫组化检测目的蛋白的表达 29-30 2.2.7 细胞生长曲线 30-31 2.3 讨论 31-33 第3章 建立的表达貉SLAM受体的Vero细胞系的评价 33-41 3.1 材料与方法 33-35 3.1.1 细胞、实验动物及病毒 33 3.1.2 主要的试剂和仪器设备 33 3.1.3 细胞对CDV 的敏感性 33-34 3.1.4 分离到病毒的RT-PCR 验证及H基因扩增 34 3.1.5 病毒滴定 34-35 3.1.6 用V-p-rSLAMh细胞分离到的LN(10)f1株细胞毒攻毒实验 35 3.2 结果 35-39 3.2.1 三株野毒株在两种细胞的培养情况 35-36 3.2.2 分离病毒的PCR 验证 36 3.2.3 LN(10)f1株CDVH基因序列比对及进化树构建 36-37 3.2.4 动物攻毒实验 37-39 3.3 讨论 39-41 结论 41-42 参考文献 42-47 攻读硕士学位期间发表的学位论文 47-48 致谢 48
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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学(兽医学) > 兽医传染病学 > 病毒病
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