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广谱趋化作用抑制剂的体内筛选及其活性鉴定

作　者: 黄伦亮
导　师: 孙晗笑
学　校: 暨南大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 噬菌体展示技术趋化因子抑制剂体内筛选
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

研究背景与目的：炎症是一些临床症状的重要病因,目前临床所用的大多数的抗炎药物(如甾体类抗炎药和非类固醇性抗炎药)的靶点均是炎症发生之后机体免疫应答的效应进程,这类药物主要是防止机体组织的损伤但并不能阻止炎症的进一步发生,并没有达到治疗炎症的最终效果。炎症感染过程中最重要的一个环节便是白细胞的募集效应。因此,以信号分子为靶点抑制白细胞过度募集对炎症的治疗有重要的作用。在过去的十多年中,介导白细胞迁移的分子信号网络的研究有了相当大的进展,其中趋化因子系统研究最为透彻。迄今为止,已开发的趋化作用抑制剂主要以单一趋化因子或其受体为靶标的特异性抑制剂为主,这类抑制剂的开发较为成熟,但其临床试验的效果不甚理想,淘汰率较高。究其原因,大多数学者认为主要是趋化因子系统的冗余性造成的。这种冗余性使得趋化因子系统十分稳固,保证了机体免疫应答的顺利发生。而大多数炎症性疾病的发生和发展的过程中有多种趋化因子及受体的参与,仅通过单纯抑制某一种趋化因子或受体的活性收效甚微。因此,开发广谱趋化作用的抑制剂是克服这一瓶颈的最佳方案,具有十分诱人的前景。寻找和设计能够广谱抑制趋化作用的分子药物,将给炎症性疾病的治疗带来新的前景。1996年以Ruoslahti、Pasqualini和Arap为主的研究小组即证明了噬菌体展示技术体内筛选方法的可行性,并使该技术得到了广泛的应用。近年来,很多研究人员利用该技术筛选到了一些特异性的靶向肽。噬菌体展示技术体内筛选方法的最大优点是能够得到特异性结合活体组织、器官等靶标并在体内具有较好的稳定性和较高特异性的小肽。本课题拟以LPS为刺激物构建大鼠炎症模型,利用噬菌体展示技术体内筛选方法,以获得高效抑制趋化因子趋化作用的小肽,为抗炎药物的研发提供先导肽。国外应用噬菌体展示技术体内筛选方法的研究均以组织或器官为靶标,真正以多种细胞因子为靶标的体内筛选则未见报道。因此,利用噬菌体展示技术,以多种趋化因子为靶标进行的广谱趋化作用抑制剂的体内筛选具有一定的创新性。研究方法：1、以5mg/kg LPS刺激SD大鼠建立炎症模型,用Luminex液相芯片法检测趋化因子CXCL类和CCL类中比较有代表性的IL-8、RANTES、MCP-1三种趋化因子表达量。2、应用噬菌体展示技术对噬菌体随机12肽库进行三轮体内亲和筛选,获得与趋化因子广谱结合的阳性噬菌体克隆。3、经体内回输实验、体外活性实验和趋化抑制实验进一步鉴定噬菌体克隆的活性,获得能够广谱抑制趋化因子趋化作用的阳性噬菌体克隆。4、应用竞争结合实验初步探讨对趋化抑制率最好的两个阳性克隆的作用机制。5、提取生物活性较好的10个阳性噬菌体克隆的DNA进行测序,据此推导插入的氨基酸序列,应用生物信息学软件对所得序列进行分析。实验结果：1、将注射LPS后各时间段的趋化因子表达量与注射LPS前的趋化因子表达量进行统计学分析P<0.05,并且注射LPS后3h趋化因子表达量最高,因此,我们选择注射LPS 3h作为炎症模型建立时间点。2、经过三轮的噬菌体展示技术体内筛选,目的噬菌体得到了有效富集,第三轮的回收量和回收率是第一轮回收量和回收率的19.4倍,与阴性对照组也有了明显的提高。3、经过体内回输实验、体外活性实验和趋化抑制实验得到十个体内外活性较好的阳性噬菌体克隆。4、通过竞争结合实验得出两个阳性噬菌体克隆的趋化抑制作用是通过阻断趋化因子与其受体结合来实现的。5、对10个趋化抑制效果比较好的阳性噬菌体进行测序,共得到5种序列,其中有两个序列出现的频率均为30%。结论：1、成功利用Luminex液相芯片技术构建了以LPS为感染源的动物炎症模型,该模型能够模拟炎症感染早期趋化因子在体内异常表达的现象。2、成功利用噬菌体展示技术体内筛选方法筛选到具有广谱趋化抑制作用的阳性噬菌体克隆,证明了噬菌体展示技术体内筛选方法的可行性。3、通过活性测定表明阳性噬菌体克隆具有较高的体内外结合活性和趋化抑制作用,初步证明了阳性噬菌体克隆是通过与趋化因子受体竞争结合趋化因子来发挥其广谱趋化抑制作用的。4、得到了具有广谱趋化抑制作用的氨基酸序列,为抗炎药物的研发提供先导肽。

全文目录

中文摘要  4-7
Abstract  7-12
缩略词表  12-13
1、绪论  13-28
  1.1 炎症反应  13-14
  1.2 趋化因子及其受体  14-16
  1.3 趋化因子及其受体与炎症反应  16-18
  1.4 Luminex液相芯片技术的发展及应用  18-21
  1.5 噬菌体展示技术的发展及应用  21-24
  1.6 针对趋化因子及其受体的药物研究现状  24
  1.7 课题研究意义及技术路线  24-28
2、实验材料与仪器  28-33
  2.1 实验动物  28
  2.2 实验仪器、设备  28-29
  2.3 实验试剂材料  29-30
  2.4 主要溶液及缓冲液的配制  30-33
3、实验方法及步骤  33-40
  3.1 炎症动物模型的建立及趋化因子IL-8,MCP-1,RANTES的检测  33-34
  3.2 噬菌体肽库的扩增  34-35
  3.3 噬菌体肽库的体内筛选  35-36
  3.4 高滴度单克隆噬菌体的制备  36
  3.5 体内回输法鉴定单个噬菌体克隆在体内的特异性靶向效果  36-37
  3.6 阳性噬菌体克隆与大鼠单个核细胞亲和力测定  37
  3.7 趋化抑制实验  37-38
  3.8 阳性噬菌体克隆作用机制的初步探讨  38
  3.9 阳性克隆DNA提取及测序  38-39
  3.10 对所得序列进行生物信息学分析  39-40
4、实验结果  40-50
  4.1 炎症动物模型建立  40-41
  4.2 三轮体内筛选后富集效应  41-42
  4.3 体内回输实验  42
  4.4 阳性噬菌体克隆与大鼠单个核细胞亲和力测定  42-44
  4.5 趋化抑制实验  44-46
  4.6 阳性噬菌体克隆作用机理初步探讨  46-47
  4.7 琼脂糖凝胶电泳结果  47-48
  4.8 测序结果及序列分析  48-50
5、讨论  50-55
  5.1 LPS感染大鼠可为炎症体内过程研究提供可靠的动物炎症模型  50
  5.2 选择IL-8、RANTES和MCP-1这三种趋化因子作为动物炎症模型的检测指标具有较好的代表性  50-51
  5.3 Luminex液相芯片技术是可靠的检测趋化因子表达量的方法  51-52
  5.4 以混合靶标进行体内筛选的优势与可行性  52-53
  5.5 趋化作用抑制肽具有良好的应用前景  53-55
6、结论与展望  55-56
  6.1 结论  55
  6.2 展望  55-56
参考文献  56-61
附录阳性噬菌体克隆DNA测序图  61-66
致谢  66

广谱趋化作用抑制剂的体内筛选及其活性鉴定

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