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蝉花免疫抑制活性成分的分离纯化工艺研究

作　者: 徐红娟
导　师: 莫志宏；毛先兵
学　校: 重庆大学
专　业: 生物化工
关键词: 蝉花多球壳菌素分离纯化柱色谱穿透曲线
分类号: TQ464
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

本论文对蝉花(Cordyceps cicadae)发酵产物中多球壳菌素的分离纯化工艺进行了深入的研究。蝉花属虫生性药用真菌,是我国传统的一种名贵中药材。蝉花与冬虫夏草同属虫菌复合体,且具有相近的药用价值。蝉花中主要成分为多球壳菌素,还有核苷类成分、麦角固醇及其过氧化物、环肽化合物、多糖、虫草酸等化学成分,具有非常广泛的生物活性。但是天然蝉花受自然条件限制,产量有限,满足不了国内外日益增长的需要,已成为稀世之珍,因而货源奇缺,供不应求,价格昂贵。多球壳菌素(ISP-1)是蝉花中一种重要的具有免疫抑制作用的物质,多用于器官移植、自身免疫性疾病等方面。除此之外,多球壳菌素还具有抗真菌、抗动脉粥样硬化等药理作用。本课题以液体深层发酵培养蝉花的发酵罐规模放大为基础,对蝉花发酵产物(发酵液和菌丝体)中多球壳菌素进行分离纯化研究,最后对目标物质进行含量鉴定和结构鉴定。此法工艺简单,所用溶剂毒性小、安全,为进一步研究蝉花及制备医药工业所需的多球壳菌素提供了依据。粗分离阶段以大孔吸附树脂为载体,通过静态吸附实验,优选出对多球壳菌素吸附性能最佳的吸附剂,同时,还对其静态吸附热力学特性进行研究;通过动态吸附实验,优化了大孔吸附树脂柱色谱的最佳工艺条件;精制阶段以柱色谱用硅胶为载体,通过TLC筛选硅胶柱色谱流动相并小试进行验证;通过抗真菌实验活性跟踪,采用NKA大孔吸附树脂和200~300目柱色谱用硅胶两步柱色谱对蝉花中抗真菌活性成分进行分离纯化;并通过红外、质谱等方法对目标化合物进行结构鉴定;还对大孔树脂吸附多球壳菌素的动力学模型进行探讨。通过对不同类型的大孔吸附树脂静态吸附性能的考察,优选出对蝉花中多球壳菌素吸附和解析性能最佳的非极性大孔吸附树脂NKA,对吸附等温线的研究表明NKA大孔吸附树脂对多球壳菌素的吸附符合Freundlich模型;对热力学特性进行研究,结果表明多球壳菌素在大孔树脂上的吸附是一个吸热过程,吸附是自发进行的;通过对NKA大孔吸附树脂动态吸附性能的研究,优化了最佳的工艺条件:上样液浓度3.0 mg/mL,pH 5.5,流速1.5 BV/h,洗脱剂为60%~70%乙醇溶液。分离纯化流程依次采用NKA大孔吸附树脂吸附、硅胶柱色谱系统,实验证明NKA大孔吸附树脂用于初步分离蝉花抗真菌活性成分是可行的,主要抗菌活性成分在60%乙醇洗脱液中;进一步通过硅胶柱色谱纯化得到单一活性成分。综合TLC、HPLC、FTIR、MS等数据确定目标物质为多球壳菌素单体。在假设和简化的基础上对大孔吸附树脂柱色谱吸附过程进行物料衡算,建立了理论穿透曲线模型,结果表明与实验穿透曲线基本吻合。由理论穿透曲线模型计算出物质的总传质系数KFav为0.0188 cm-1以及物质的传质区间长度为8.96 cm。上述研究结果的取得,为蝉花中多球壳菌素分离纯化提供了有力的理论和实践指导,特别是为进一步研究蝉花及制备医药工业所需的多球壳菌素提供了坚实的实验基础;通过大孔吸附树脂吸附多球壳菌素吸附透过曲线模型的建立,为柱层析的放大效应及放大规律的获取打开了方便之门。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-10
中英文对照表  10-11
1 绪论  11-20
  1.1 问题的提出及研究意义  11-13
    1.1.1 问题的提出  11-12
    1.1.2 研究意义  12-13
  1.2 国内外研究现状  13-17
    1.2.1 蝉花背景资料简介  13
    1.2.2 蝉花化学成分及药理作用  13-17
    1.2.3 蝉花有效成分提取分离方法的的研究进展  17
  1.3 课题研究的目的、论文的主要内容及创新性  17-20
    1.3.1 课题研究的目的  17-18
    1.3.2 论文的主要内容  18
    1.3.3 本研究的创新性  18-20
2 大孔吸附树脂的吸附特性研究  20-37
  2.1 大孔吸附树脂的结构、特性及分离原理  20
  2.2 分类及性能  20-21
  2.3 实验仪器与试剂  21
    2.3.1 主要仪器  21
    2.3.2 主要试剂与材料  21
  2.4 实验方法  21-25
    2.4.1 大孔吸附树脂的预处理和物理性能  21-22
    2.4.2 样品的制备与测定方法  22-23
    2.4.3 树脂的静态吸附实验  23-24
    2.4.4 大孔吸附树脂的动态吸附实验  24-25
  2.5 结果与讨论  25-35
    2.5.1 检测波长的确定  25
    2.5.2 线性关系的考察  25-26
    2.5.3 大孔吸附树脂对多球壳菌素的静态吸附  26-27
    2.5.4 树脂静态吸附过程的动力学特征  27-28
    2.5.5 大孔吸附树脂吸附等温曲线  28-31
    2.5.6 吸附热力学特性  31-32
    2.5.7 树脂对多球壳菌素的动态吸附  32-35
  2.6 结论  35-37
3 蝉花免疫抑制成分ISP-1 的分离纯化研究  37-51
  3.1 引言  37
  3.2 大孔树脂和硅胶两步柱层析分离纯化多球壳菌素的研究  37-38
    3.2.1 大孔吸附树脂简介  37-38
    3.2.2 硅胶简介  38
  3.3 实验仪器、材料与试剂  38-39
    3.3.1 主要仪器  38-39
    3.3.2 主要材料与试剂  39
  3.4 实验方法  39-42
    3.4.1 蝉花发酵放大培养  39-40
    3.4.2 蝉花上柱样品的制备  40
    3.4.3 薄层色谱(TLC)条件  40
    3.4.4 高效液相色谱(HPLC)条件  40
    3.4.5 质谱条件  40
    3.4.6 红外光谱条件  40
    3.4.7 薄层抗真菌实验方法  40-41
    3.4.8 杯碟法抗真菌实验方法  41
    3.4.9 最小抑菌浓度MIC 的测定  41
    3.4.10 大孔吸附树脂柱色谱  41-42
    3.4.11 硅胶柱色谱  42
  3.5 结果与讨论  42-50
    3.5.1 蝉花发酵罐放大培养结果  42
    3.5.2 大孔吸附树脂柱色谱  42-43
    3.5.3 硅胶柱色谱  43-45
    3.5.4 硅胶柱色谱洗脱活性馏分最小抑菌浓度(MIC)的测定  45-46
    3.5.5 高效液相色谱（HPLC）分析  46-47
    3.5.6 产物鉴定  47-50
  3.6 结论  50-51
4 大孔树脂吸附ISP-1 动力学模型研究  51-60
  4.1 引言  51-52
  4.2 基本理论  52
  4.3 模型的建立  52-54
  4.4 计算方法  54-57
    4.4.1 贝塞尔函数的算法  54-55
    4.4.2 理论透过曲线的计算  55
    4.4.3 目标函数的选择  55-56
    4.4.4 优化方法  56-57
  4.5 结果与讨论  57-59
  4.6 结论  59-60
5 结语与展望  60-62
致谢  62-63
参考文献  63-66
附录  66
  A. 作者在攻读硕士学位期间发表（含录用）的论文目录  66
  B. 作者在攻读硕士学位期间取得的的科研成果目录  66

蝉花免疫抑制活性成分的分离纯化工艺研究

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