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CD63基因在小鼠围着床期子宫中的表达和调节

作　者: 杨新玲
导　师: 杨增明
学　校: 厦门大学
专　业: 细胞生物学
关键词: CD63 着床蜕膜
分类号: Q492
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

胚胎着床是一个复杂的过程,需要活化的胚泡与进入接受态的子宫内膜之间建立联系。在啮齿类动物,着床过程启动后,子宫内膜基质细胞发生广泛的蜕膜化,为接下来的胚胎及胎盘发育做准备。胚胎着床和子宫蜕膜化受到很多因素调控,但具体的分子机理仍不清楚。我们实验室利用基因表达系列分析(SAGE)技术发现,与非着床位点相比,CD63(CD63 antigen)基因在小鼠的着床位点显著上调。CD63属于四次跨膜蛋白超家族,在人黑色素瘤等多种肿瘤发展中起重要作用,被称为肿瘤转移抑制因子。本实验利用原位杂交、实时定量RT-PCR、Westernblot和荧光素酶活性分析等方法,研究了CD63基因在围着床期小鼠子宫中的表达与调节。CD63的mRNA和蛋白水平在妊娠第5天子宫的着床位点均显著上调,在随后第6-8天的蜕膜区,均可检测到明显的CD63 mRNA表达信号。在假孕和延迟着床的子宫中,检测不到CD63基因的表达,而在延迟激活子宫的着床位点,CD63基因的表达特异性增强,其表达模式与正常妊娠第5天着床位点处类似。CD63 mRNA在小鼠妊娠第6-8天的蜕膜区表达,同时在人工诱导蜕膜化的小鼠子宫中也能检测到CD63基因的杂交信号,实时定量RT-PCR也验证了此结果,提示CD63基因可能在蜕膜化过程发挥作用。在切除卵巢的小鼠中,类固醇激素对CD63在子宫内的表达没有影响。体外诱导蜕膜化中,CD63 mRNA表达持续上调。CD63基因启动子上存在转录因子C/EBPβ反应元件,将含有CD63基因启动子序列的报告载体转染体外培养的子宫内膜基质细胞和NIH-3T3细胞后,通过荧光素酶活性分析,表明C/EBPβ能够显著增加CD63基因的转录活性。总之,CD63基因在小鼠围着床期子宫中的表达与胚胎着床过程密切相关,并受活性胚泡的诱导。CD63基因在小鼠子宫基质细胞体外蜕膜化过程中表达上调。此外,转录因子C/EBPβ上调CD63基因的转录活性。

全文目录

摘要  12-13
Abstract  13-15
1 前言  15-27
  1.1 胚胎着床的研究进展  15-20
    1.1.1 胚胎着床与子宫蜕膜化  15-17
    1.1.2 胚胎着床与子宫蜕膜化的分子调控  17-20
  1.2 CD63的研究进展  20-25
    1.2.1 四次跨膜蛋白超家族  20-21
    1.2.2 CD63的基因结构  21-22
    1.2.3 CD63与肿瘤  22-23
    1.2.4 CD63与人免疫缺陷病毒1  23-24
    1.2.5 CD63与生殖系统  24-25
  1.3 本研究的目的与意义  25-27
2 材料与方法  27-49
  2.1 实验动物  27
  2.2 实验动物模型及取材  27-28
    2.2.1 早期妊娠  27
    2.2.2 假孕  27
    2.2.3 延迟着床与激活  27-28
    2.2.4 人工诱导蜕膜化  28
    2.2.5 类固醇激素处理  28
  2.3 小鼠体外诱导蜕膜化模型  28-30
    2.3.1 所需药品及试剂  28-29
    2.3.2 小鼠子宫内膜基质细胞的分离培养流程  29-30
    2.3.3 小鼠子宫内膜基质细胞的体外诱导蜕膜化  30
  2.4 CD63基因的克隆及cRNA探针的制备  30-35
    2.4.1 菌种及主要分子生物学试剂  30
    2.4.2 PCR引物设计  30-31
    2.4.3 组织中总RNA的提取  31
    2.4.4 DNA的消化  31
    2.4.5 反转录  31-32
    2.4.6 PCR反应  32
    2.4.7 扩增产物的回收及载体连接  32-33
    2.4.8 感受态细胞的制备  33-34
    2.4.9 重组质粒的转化、测序及方向鉴定  34
    2.4.10 cRNA片段的地高辛标记  34-35
  2.5 原位杂交  35-37
    2.5.1 载玻片的处理  35
    2.5.2 冰冻切片方法  35
    2.5.3 杂交试剂及溶液  35-36
    2.5.4 原位杂交流程  36-37
  2.6 Real-Time PCR  37-40
    2.6.1 实时定量PCR引物的设计  37-38
    2.6.2 总RNA的提取  38
    2.6.3 DNA的消化  38
    2.6.4 反转录反应  38-39
    2.6.5 实时定量PCR反应  39
    2.6.6 融解曲线的分析  39-40
    2.6.7 ~(ΔΔ)Ct法分析基因表达的相对差异  40
  2.7 Western Blot  40-44
    2.7.1 样品的提取  40-41
    2.7.2 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳  41-42
    2.7.3 Immunoblot及显影  42
    2.7.4 Western blot试剂及溶液  42-44
  2.8 CD63启动子分析  44-49
    2.8.1 CD63启动子载体的构建  44-46
    2.8.2 细胞培养  46-47
    2.8.3 转染细胞  47-48
    2.8.4 荧光素酶活性分析  48-49
3 结果  49-63
  3.1 CD63基因的克隆和鉴定  49
  3.2 CD63基因在围着床期小鼠子宫中的表达  49-52
    3.2.1 原位杂交检测CD63基因在围着床期小鼠子宫中的表达  49-50
    3.2.2 Real Time PCR验证CD63基因在妊娠第5天子宫中的表达  50-51
    3.2.3 Western blot检测妊娠第5天子宫中CD63蛋白水平及变化  51-52
  3.3 活性胚泡对围着床期子宫中CD63基因表达的影响  52-54
    3.3.1 原位杂交检测CD63基因在假孕子宫中的表达  52-53
    3.3.2 原位杂交检测CD63基因在延迟着床和激活子宫中的表达  53-54
  3.4 CD63基因在蜕膜化子宫中的表达  54-56
    3.4.1 原位杂交检测CD63基因在人工蜕膜化子宫中的表达  54-55
    3.4.2 Real Time PCR验证CD63基因在蜕膜化子宫中的表达  55-56
  3.5 类固醇激素对CD63基因在子宫中表达的影响  56-57
  3.6 CD63基因在体外蜕膜化过程中的表达  57-59
    3.6.1 Dtprp在体外蜕膜化模型中的表达  57-58
    3.6.2 CD63 mRNA在体外蜕膜化过程中的表达  58-59
  3.7 C/EBP β对CD63基因启动子活性的调节  59-63
4 讨论  63-67
  4.1 CD63在围着床期子宫中的表达  63-64
  4.2 围着床期子宫中CD63基因的调节  64
  4.3 CD63在体外蜕膜化过程中的表达  64-65
  4.4 转录因子C/EBP β对CD63表达的调节  65-67
5 结论  67-69
参考文献  69-83
致谢  83

CD63基因在小鼠围着床期子宫中的表达和调节

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