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以噬菌体展示肽库筛选肺癌清特异性多肽及肿瘤标志物

作　者: 周捷
导　师: 臧林泉
学　校: 广东药学院
专　业: 药物化学
关键词: 肺癌血清噬菌体展示随机肽库噬菌体展示肺癌cDNA文库 CD63
分类号: R734.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的:以噬菌体展示肽库筛选能够用于肺癌血清学筛查和病理分型的多肽。再以噬菌体展示肺癌cDNA文库筛选及鉴定该多肽结合的靶分子。方法:利用M13噬菌体随机12肽展示肽库对24例临床确诊肺癌病人的血清和24例体检者的血清进行4轮递减筛选。随机挑取筛选后的噬菌体单克隆,皆以血清和细胞株进行Elisa试验,选出特异性及确诊率最高的单克隆。目标单克隆通过DNA测序确定其所表达的多肽序列,进而人工合成标记FITC的多肽,以肺癌血清检测合成多肽的肺癌确诊率,再利用细胞株(A549,NCI-H1299,WI-38)和组织切片通过荧光成像,检测合成多肽的特异性。然后,又以量子点标记多肽,以荷瘤裸鼠检测多肽在体内的靶向性。将偶联生物素的多肽结合于包被亲和素的酶标板内,对T7噬菌体展示肺癌cDNA文库进行3轮筛选,随机挑取20个单克隆进行DNA测序后,通过美国国立生物技术信息中心Blast数据库搜索和鉴定各单克隆所展示的蛋白(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST),并根据各个蛋白在20个T7单克隆中出现的频率而初步确定多肽识别的靶分子。结果:随机挑取30个经过4轮筛选的噬菌体单克隆,通过血清Elisa试验,筛选出5个的阳性单克隆,其中特异性和确诊率最高的是单克隆ZZ-8的肺癌总确诊率达到45.8%,且鳞癌的检出率为87.5%,腺癌检出率为33.3%,腺鳞癌为50.0%。细胞ELISA检测表明ZZ-8主要结合在癌细胞上,包括A549和NCI-H1299,而基本不与肺正常细胞WI-38结合。单克隆ZZ-8经DNA测序分析,确定其表达的多肽序列为:HSLKSTVDALWW。免疫荧光化学检测显示,FITC标记的多肽的总确诊率达到41.7%,而鳞癌的检出率为75.0%,腺癌检出率为66.7%,腺鳞癌为25.0%。荧光成像检测表明FITC标记的多肽选择性地结合于肺癌细胞和肺癌组织切片上,而基本不与正常细胞和癌旁组织切片结合。量子点标记的多肽在裸鼠体内仍能够表现出较好的靶向性,其主要分布在肿瘤,肝,肾,而其他器官几乎没有分布。在3轮筛选后,随机挑取20个T7噬菌体单克隆进行DNA测序,所得结果在美国国立生物技术信息中心Blast数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)搜索出9种蛋白,其中出现频率最高的是CD63,所占比例为30.0%。结论:筛选出的多肽ZZ-8的氨基酸序列为HSLKSTVDALWW,其对肺癌血清中的蛋白和肺癌细胞或组织具有良好的特异性。初步认定ZZ-8所识别的肺癌相关蛋白是CD63。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-10
前言  10-12
第一章肺癌血清特异性结合多肽的筛选  12-20
  引言  12-13
  1. 材料  13-15
  2 方法  15-17
  3 结果  17-18
  4 讨论  18-20
第二章特异性结合单克隆的挑选及鉴定  20-33
  引言  20
  第一节肺癌血清阳性单克隆的挑选  20-28
    摘要  20
    1 材料  20-22
    2 方法  22-23
    3 结果  23-27
    4 讨论  27-28
  第二节阳性单克隆的细胞免疫化学鉴定  28-33
    摘要  28
    1 材料  28-30
    2 方法  30-31
    3 结果  31-32
    4 讨论  32-33
第三章人工合成多肽的特异性检测  33-44
  引言  33
  第一节 FITC 标记多肽的特异性鉴定  33-39
    摘要  33
    1 材料  33-35
    2 方法  35
    3 结果  35-37
    4 讨论  37-39
  第二节量子点标记多肽的体内靶向性鉴定  39-44
    摘要  39
    1 材料  39-40
    2 方法  40-41
    3 结果  41-42
    4 讨论  42-44
第四章肺癌特异性结合多肽靶蛋白的筛选及鉴定  44-52
  引言  44-52
    1 材料  44-45
    2 方法  45-47
    3 结果  47-49
    4 讨论  49-52
结论与创新性  52-53
参考文献  53-59
附录  59-62
攻读学位期间发表的主要论文  62-63
致谢  63

以噬菌体展示肽库筛选肺癌清特异性多肽及肿瘤标志物

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