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以噬菌体展示肽库筛选肺癌清特异性多肽及肿瘤标志物
作 者: 周捷
导 师: 臧林泉
学 校: 广东药学院
专 业: 药物化学
关键词: 肺癌血清 噬菌体展示随机肽库 噬菌体展示肺癌cDNA文库 CD63
分类号: R734.2
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要
目的:以噬菌体展示肽库筛选能够用于肺癌血清学筛查和病理分型的多肽。再以噬菌体展示肺癌cDNA文库筛选及鉴定该多肽结合的靶分子。方法:利用M13噬菌体随机12肽展示肽库对24例临床确诊肺癌病人的血清和24例体检者的血清进行4轮递减筛选。随机挑取筛选后的噬菌体单克隆,皆以血清和细胞株进行Elisa试验,选出特异性及确诊率最高的单克隆。目标单克隆通过DNA测序确定其所表达的多肽序列,进而人工合成标记FITC的多肽,以肺癌血清检测合成多肽的肺癌确诊率,再利用细胞株(A549,NCI-H1299,WI-38)和组织切片通过荧光成像,检测合成多肽的特异性。然后,又以量子点标记多肽,以荷瘤裸鼠检测多肽在体内的靶向性。将偶联生物素的多肽结合于包被亲和素的酶标板内,对T7噬菌体展示肺癌cDNA文库进行3轮筛选,随机挑取20个单克隆进行DNA测序后,通过美国国立生物技术信息中心Blast数据库搜索和鉴定各单克隆所展示的蛋白(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST),并根据各个蛋白在20个T7单克隆中出现的频率而初步确定多肽识别的靶分子。结果:随机挑取30个经过4轮筛选的噬菌体单克隆,通过血清Elisa试验,筛选出5个的阳性单克隆,其中特异性和确诊率最高的是单克隆ZZ-8的肺癌总确诊率达到45.8%,且鳞癌的检出率为87.5%,腺癌检出率为33.3%,腺鳞癌为50.0%。细胞ELISA检测表明ZZ-8主要结合在癌细胞上,包括A549和NCI-H1299,而基本不与肺正常细胞WI-38结合。单克隆ZZ-8经DNA测序分析,确定其表达的多肽序列为:HSLKSTVDALWW。免疫荧光化学检测显示,FITC标记的多肽的总确诊率达到41.7%,而鳞癌的检出率为75.0%,腺癌检出率为66.7%,腺鳞癌为25.0%。荧光成像检测表明FITC标记的多肽选择性地结合于肺癌细胞和肺癌组织切片上,而基本不与正常细胞和癌旁组织切片结合。量子点标记的多肽在裸鼠体内仍能够表现出较好的靶向性,其主要分布在肿瘤,肝,肾,而其他器官几乎没有分布。在3轮筛选后,随机挑取20个T7噬菌体单克隆进行DNA测序,所得结果在美国国立生物技术信息中心Blast数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)搜索出9种蛋白,其中出现频率最高的是CD63,所占比例为30.0%。结论:筛选出的多肽ZZ-8的氨基酸序列为HSLKSTVDALWW,其对肺癌血清中的蛋白和肺癌细胞或组织具有良好的特异性。初步认定ZZ-8所识别的肺癌相关蛋白是CD63。
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全文目录
摘要 6-8 Abstract 8-10 前言 10-12 第一章 肺癌血清特异性结合多肽的筛选 12-20 引言 12-13 1. 材料 13-15 2 方法 15-17 3 结果 17-18 4 讨论 18-20 第二章 特异性结合单克隆的挑选及鉴定 20-33 引言 20 第一节 肺癌血清阳性单克隆的挑选 20-28 摘要 20 1 材料 20-22 2 方法 22-23 3 结果 23-27 4 讨论 27-28 第二节 阳性单克隆的细胞免疫化学鉴定 28-33 摘要 28 1 材料 28-30 2 方法 30-31 3 结果 31-32 4 讨论 32-33 第三章 人工合成多肽的特异性检测 33-44 引言 33 第一节 FITC 标记多肽的特异性鉴定 33-39 摘要 33 1 材料 33-35 2 方法 35 3 结果 35-37 4 讨论 37-39 第二节 量子点标记多肽的体内靶向性鉴定 39-44 摘要 39 1 材料 39-40 2 方法 40-41 3 结果 41-42 4 讨论 42-44 第四章 肺癌特异性结合多肽靶蛋白的筛选及鉴定 44-52 引言 44-52 1 材料 44-45 2 方法 45-47 3 结果 47-49 4 讨论 49-52 结论与创新性 52-53 参考文献 53-59 附录 59-62 攻读学位期间发表的主要论文 62-63 致谢 63
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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 呼吸系肿瘤 > 肺肿瘤
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