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大鼠视网膜微循环及白细胞运动初步研究

作　者: 张迁
导　师: 张作明
学　校: 第四军医大学
专　业: 航空、航天与航海医学
关键词: 大鼠视网膜微循环白细胞运动眼底荧光素血管造影
分类号: R774.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

白细胞渗出是炎症反应的最重要特征性改变。它是一个复杂的连续过程,包括白细胞的边集、附壁、黏附和游出等阶段,并在趋化因子的作用下运动到炎症灶,在局部发挥重要的防御作用。利用活体荧光显微镜能够在体观察到白细胞的渗出过程,从而能够对不同炎症或炎症不同阶段的特点有深入的了解,但是观察部位,如肠系膜[1]、软脑膜[2]等为一种有创观察,不利于长期的动态观察。眼底的微循环可以很直观的观察到,而且不会对被试造成损伤,另外,眼底微循环和大脑微循环非常相似,也可以作为研究大脑微循环的一个窗口。近年来,扫描激光检眼镜(scanning laser ophthalmoscopy SLO)被应用于研究病理和生理条件下在体视网膜微循环内的白细胞动力学。Hossain等[3]报道利用共焦扫描激光检眼镜对大鼠进行在体的非侵入性白细胞示踪技术;Xu等[4]报道利用专门为小鼠定制的扫描激光检眼镜对小鼠进行在体的非侵入性白细胞示踪技术。Maass等[5]通过利用HRA2(共焦激光眼底血管造影仪)和扫描激光检眼镜(Zeiss confocal scanning laser ophthalmoscopy cSLO)分别对小鼠凋亡的神经节细胞进行观察和照相,发现前者能够更有效而清楚的成像,特别是在荧光点的成像方面,HRA2表现出了明显的优势。但是该方法要求条件比较高,相关报道比较少。为深入探索视网膜疾病的发病机制,建立一套观察和记录视网膜微循环变化和白细胞运动的方法,我们利用HRA2对正常大鼠眼底血管的形态和分布以及白细胞的运动情况进行观察和照相,建立了大鼠视网膜荧光血管造影和白细胞运动的观察方法。本课题主要从以下几个方面进行了研究:1、观察和记录了SD大鼠和BN大鼠的荧光素眼底血管造影情况;2、观察和记录了SD大鼠和BN大鼠眼底血管中白细胞运动的情况;3、观察了激光光凝术后SD大鼠和BN大鼠眼底血管中白细胞运动和分布情况。材料和方法1材料选取4窝健康无眼疾的SD(Sprague Dawley)大鼠(第四军医大学航空航天临床医学教研室屏障动物实验室)40只,每窝10只,体重200-300g;BN(Brown Norway)大鼠一窝6只,体重180g左右,雌雄不分,室温环境下饲养,将其中的3窝分别随机分为2组,各5只,BN大鼠也随机分为2组,各3只,随机选其中一组用于心脏采血,另一组用于观察眼底血管及白细胞运动。第1窝(未分组的一窝)用于荧光素眼底血管造影以观察眼底血管的形态和分布;第2窝用于观察无ConA激活条件下白细胞在眼底血管中的运动情况。第3窝用于观察ConA激活条件下白细胞在眼底血管中的运动情况。第4窝和BN大鼠用于观察激光光凝术后眼底白细胞的运动情况。共焦激光眼底血管造影仪(HRA2)由德国海德堡工程公司生产。每窝大鼠的其中一组用于心脏采血约7-10ml,如果一只大鼠采不到足够的血量,可以一次采多只大鼠的血液,以期能够分离到足量的白细胞用于观察。分离液采用大鼠白细胞分离液LTS 1083(天津灏洋生物制品科技有限责任公司)。2方法2.1眼底荧光素血管造影(FFA)成年SD大鼠1只,0.7ml/kg速眠新注射液(军事医学科学院军事兽医研究所)ip麻醉,5g/L复方托吡卡胺滴眼液(北京双鹤现代医药技术有限责任公司产品)散瞳,将动物置于动物台上,调整台面高度使其与仪器相适应,将眼睛对准镜头,调试仪器开始观察眼底,等看到眼底时,尾静脉注射100g/L(原液浓度为200g/L,加入等体积的生理盐水稀释至100g/L)荧光素钠注射液[6](广西梧州制药股份有限公司) 0.5ml/kg,为了保证观察的连续性,之后只对一侧眼进行观察和照相。观察过程中每隔1-2min都要在双眼点泪然滴眼液(美国爱尔康公司),以防止角膜干燥。2.2眼底白细胞运动的观察经心脏采的新鲜抗凝血立即与Hank’s液1:1混匀,将混合液缓慢加入等体积的大鼠淋巴细胞分离液中,进行密度梯度离心,收集分离出来的白细胞。经细胞计数板计数,白细胞数约为1×109个/L血液,其中淋巴细胞约占60-70%,单核细胞和粒细胞约占30-40%。将所得细胞用Hank’s液离心漂洗3次以后再将这些细胞悬浮于RPMI1640培养液5ml中,将其中一窝5只大鼠所分离出来的白细胞与CFDA[3] 0.5mg共孵育30min(370C),可见细胞悬液呈金黄色,然后用Hank’s离心漂洗3次,最后将所得细胞悬浮于1ml的RPMI1640培养液中以备用,经细胞计数板计数,白细胞数约为(5-7)×109个/L。另外一窝的5只大鼠用同样的方法分离白细胞。为了激活这些细胞,将其悬浮于完全培养液[含2.5mg/LConA(Sigma)] 10ml中,共孵育30min(37oC),之后再用RPMI1640培养液离心漂洗3次,并以同样的方法制备CFDA标记的细胞悬液以备用。将上述两窝的另外一组大鼠分别进行眼底观察照相。尾静脉注射10g/L荧光素钠0.1ml以显示其血管的轮廓,将同窝其中一组5只大鼠分离得到的CFDA标记的白细胞分别经尾静脉注入同窝另外5只大鼠体内,HRA2下观察,照相。同上方法,先对同窝另一组大鼠分别进行眼底照相、荧光素背景衬染,再经尾静脉注射CFDA标记的白细胞悬液,观察经ConA刺激后的白细胞是否更容易发生渗出。观察过程中每隔1-2min在双眼点泪然滴眼液。当图象不清楚时,需要及时调整仪器之外,也要不断调整大鼠的被检测眼和镜头之间的位置关系。将最后一窝SD大鼠中的其中一组5只大鼠和BN大鼠的其中一组3只大鼠进行眼底激光光凝术,光斑能量为0.3W(BN大鼠采用0.08W的光斑能量),曝光时间0. 1 s,光斑直径50μm,分别在各个大鼠的鼻侧或颞侧密集的打了52个点,以在裂隙灯下看到打激光处产生气泡为准,产生的光斑基本上为4级光斑。然后用上述同样的方法在光凝手术后2d和3d分别观察白细胞在眼底血管中的运动情况。结果1荧光素血管造影经HRA2下可以清楚地观察到大鼠眼底血管的走向,分布和形态。正常大鼠眼底血管走行正常,无迂曲、渗出和出血等情况。最小可以看到4级血管(自视盘分枝算1级血管)。大鼠荧光素眼底血管造影过程中由于血液循环短、速度快,很难和人眼底血管造影那样分为明显的动脉相、毛细血管相和静脉相。根据眼底血管的充盈和显像情况可以简单的分为早期相(荧光素注入后1-3s,可以看到眼底1级血管的充盈和显像),中期相(荧光素注入后3s-5min,可以看到视网膜的小血管,最小到4级血管都可以显像),后期相(荧光素注入5min以后,可以清楚地看到视网膜的血管显像和逐渐变亮的背景,后者是由于脉络膜血管荧光素渗漏所致)。BN大鼠由于眼底有色素,荧光素造影显像更清楚,而且拍摄时间更长,在荧光素注入后2h仍然能够清晰地看到眼底血管的走形和轮廓。2眼底血管白细胞运动在HRA2下能够观察到正常大鼠眼底血管中运动的白细胞,ConA激活组的白细胞在视野中更多也更容易观察到,而且它们在血管中运动速度相对较慢,表现为同样的时间内视野中可以看到更多的白细胞,部分白细胞在视野中停留的时间更长。而正常组白细胞在眼底血管中的运动速度很快,有些运动速度很快的白细胞在视野中一闪而过,视野中的白细胞数量也相对较少。还有一些在组织中或小血管中的白细胞运动速度比较慢,可以清楚的看到白细胞运动的轨迹,另外还可以看到个别白细胞在血管内的黏附,跨膜和滚动的情况。白细胞运动在激光光凝组与对照组未见明显区别,唯一可以观察到的就是激光光凝区可以看到稍多的脉络膜荧光渗漏。结论1.HRA2可以有效地观测并记录到大鼠视网膜血管形态及白细胞运动的情况,可以作为研究大鼠视网膜微循环及眼底白细胞运动的有效工具;2.与SD大鼠相比,BN大鼠由于其带有色素,可以更清楚而有效地观察到眼底血管及白细胞运动的情况;3.激光光凝术后,未观察到标记的白细胞在损伤部位渗出,具体原因还有待于进一步观察。

全文目录

缩略语表  6-7
中文摘要  7-12
ABSTRACT  12-17
前言  17-18
文献回顾  18-35
正文  35-49
  实验一大鼠眼底荧光素血管造影  35-40
    1 材料  35-36
      1.1 实验用动物  35-36
      1.2 试剂与药品  36
      1.3 仪器设备  36
    2 方法  36-37
    3 结果  37
    4 讨论  37-40
  实验二大鼠眼底白细胞运动的观察  40-45
    1 材料  40-41
      1.1 实验用动物  40
      1.2 试剂与药品  40-41
      1.3 仪器设备  41
    2 方法  41-43
      2.1 白细胞的分离与标记  41-42
      2.2 HRA2 下观察眼底白细胞的运动  42-43
    3 结果  43
    4 讨论  43-45
  实验三眼底激光光凝术后大鼠眼底白细胞运动的观察  45-49
    1 材料  45-46
      1.1 实验用动物  45
      1.2 试剂与药品  45-46
      1.3 器材  46
    2 方法  46-47
      2.1 眼底激光光凝术  46
      2.2 白细胞的分离与标记  46-47
      2.3 眼底激光光凝术后观察眼底白细胞的运动  47
    3 结果  47-48
    4 讨论  48-49
小结  49-51
参考文献  51-61
附图  61-65
个人简历  65-66
发表文章及研究成果  66-67
致谢  67

大鼠视网膜微循环及白细胞运动初步研究

内容摘要

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