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白令海北部浮游细菌及表层沉积物细菌的系统发育多样性分析

作　者: 邹扬
导　师: 郑天凌；曾胤新
学　校: 厦门大学
专　业: 微生物学
关键词: 白令海 PCR-DGGE 16S rDNA文库细菌多样性
分类号: Q938
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 135次
引　用: 2次
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内容摘要

本研究结合变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术、克隆文库技术和限制酶切片段长度多态性(RFLP)等分子生物学手段,首次对白令海北部底、表层水体以及表层沉积物中的细菌群落结构进行比较与分析,并利用Bandscan及多样性指数对该区域浮游细菌及表层沉积物细菌的生物多样性进行评估,取得了以下主要结果:1.通过PCR-DGGE分析,发现白令海北部底、表层海水中的细菌生物多样性水平总体较高,而且底层水体中细菌多样性指数及丰度明显高于表层水体;St.Lawrence岛北部7个站位的表层和底层水样,其丰度和多样性指数平均值低于南部区域;采样深度大于100m的3个站位的底层水样,其多样性指数随着深度的增加出现递增现象。获得的36条DGGE条带,其序列除了有2条属于环境样品中的未知菌群以外,涵盖了以Proteobacteria和Actinobacteria为主的6个门。其中,gamma-Proteobacteria和alpha-Proteobacterium分别以25.0%和22.2%占据优势地位。另外还包括:Actinobacteria(16.7%),Cyanobacteria(11.1%),delta-Proteobacteria(5.6%),beta-Proteobacteria(2.8%),Firmicutes(5.6%),Bacteroidetes(2.8%)和Verrucomicrobia(2.8%)。其中83.3%的序列与GenBank数据库中未培养微生物的相似性很高,说明白令海北部底、表层海水中,蕴藏着丰富的未培养微生物资源。2.对该海域19个站位沉积物样品的PCR-DGGE分析表明,白令海北部表层沉积物中的细菌多样性指数、均匀度指数以及丰度的平均值,均明显高于底、表层水样的结果。在深度大于100m的几个站位中,DBSA站位的多样性指数及均匀度指数均为最大,而DBSE和DBS1站位的丰度值则在沉积物的19个站位中处于最高。获得的37条DGGE条带,有56.8%属于Proteobacteria,其中delta-Proteobacteria(32.4%)与gamma-Proteobacteria(18.9%)占据优势地位。此外还有:Bacteroidetes(13.5%),Actinobacteria(8.1%),Acidobacteria(8.1%)和Cyanobacteria(2.7%)。另有10.8%的序列属于环境样品中的未知菌群。3.构建了NEC5、DBSE和DBS1三个站位表层沉积物细菌的16S rDNA文库,发现其涵盖了包括Proteobacteria和Acidobacteria等在内的10-13个门。具体包括:alpha-,beta-,gamma-,delta-和epsilon-Proteobacteria,Acidobacteria,Bacteroidetes,Actinobacteria,Planctomycetes,Nitrospirae,Verrucomicrobia,Chloroflexi,Firmicutes,Chlorobi bacterium,Gemmatimonadetes,Cyanobacterium,Fibrobacteres和Spirochaetes等。在表层沉积物中最丰富的微生物类群为Proteobacteria,约占所有克隆子的一半。其中delta-Proteobacteria在3个站位中均为优势类群,其次是gamma-Proteobacteria和Acidobacteria。所测序列与GeneBank中已知细菌序列的相似性在84.1-99.8%,其中41%的序列同源性≤95%,说明该海域沉积物环境中蕴藏着丰富的未知微生物资源。与白令海沉积物细菌具有较近亲缘关系的序列,有99.8%都来自不可培养的细菌。

全文目录

摘要  10-12
Abstract  12-14
1 前言  14-27
  1.1 海洋微生物及其多样性  14-16
    1.1.1 海洋微生物及其生态功能  14-15
    1.1.2 海洋微生物的多样性及其研究意义  15-16
  1.2 海洋细菌多样性的分析方法  16-22
    1.2.1 传统分离培养方法  16
    1.2.2 现代分子生态学方法  16-22
  1.3 白令海细菌多样性研究  22-25
    1.3.1 白令海概况  22-23
    1.3.2 白令海及其它极地海域的细菌多样性研究进展  23-25
  1.4 本论文的研究思路和意义  25-27
2 材料与方法  27-45
  2.1 材料  27-36
    2.1.1 采样点概况与样品采集  27-31
    2.1.2 菌株和质粒  31
    2.1.3 滤膜  31
    2.1.4 主要试剂  31
    2.1.5 工具酶  31
    2.1.6 引物  31-32
    2.1.7 主要仪器  32
    2.1.8 培养基  32-33
    2.1.9 溶液配制  33-35
    2.1.10 分析软件  35-36
  2.2 基本方法  36-45
    2.2.1 白令海北部底、表层水体浮游细菌的群落结构与多样性分析  36-43
      2.2.1.1 样品的采集与前处理  36
      2.2.1.2 水样细菌基因组总DNA的提取  36-37
      2.2.1.3 16S rDNA片段的PCR扩增  37-38
      2.2.1.4 16SrDNA-V3区的PCR扩增  38
      2.2.1.5 变性梯度凝胶电泳(DGGE)及细菌多样性分析  38-43
    2.2.2 沉积物细菌的群落结构与多样性分析  43-45
      2.2.2.1 沉积物细菌基因组总DNA的提取  43
      2.2.2.2 16S rDNA片段的PCR扩增  43
      2.2.2.3 16S rDNA-V3区的PCR扩增  43
      2.2.2.4 变性梯度凝胶电泳(DGGE)及细菌多样性分析  43
      2.2.2.5 细菌16S rDNA文库的构建  43-45
3 结果与分析  45-82
  3.1 白令海北部底、表层水体浮游细菌的多样性研究  45-56
    3.1.1 底、表层浮游细菌基因组总DNA的提取  45
    3.1.2 底、表层浮游细菌16S rDNA片段的PCR扩增  45-46
    3.1.3 基于DGGE图谱的底、表层浮游细菌多样性的比较分析  46-52
    3.1.4 底、表层浮游细菌优势种群的分子鉴定与系统发育分析  52-56
  3.2 白令海北部表层沉积物细菌的多样性研究  56-82
    3.2.1 表层沉积物细菌基因组总DNA的提取  56
    3.2.2 表层沉积物细菌16S rDNA片段的PCR扩增  56-57
    3.2.3 基于DGGE图谱的表层沉积物细菌多样性分析  57-66
    3.2.4 基于16S rDNA文库的表层沉积物细菌多样性分析  66-82
4 讨论  82-92
  4.1 白令海北部底、表层水体浮游细菌的多样性分析  82-85
    4.1.1 底、表层水体浮游细菌的系统发育多样性分析  82-84
    4.1.2 底、表层水体浮游细菌的优势菌群分析  84-85
  4.2 白令海北部表层沉积物细菌的多样性分析  85-88
    4.2.1 沉积物细菌的系统发育多样性分析  85-86
    4.2.2 沉积物细菌的优势类群分析  86-88
  4.3 关于分子生物学技术在本次研究应用过程中的若干问题  88-92
    4.3.1 剪膜法与洗膜法对DNA提取效果的影响  88-89
    4.3.2 直接PCR与巢式PCR对DGGE的影响  89-90
    4.3.3 采用变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术与16S rDNA克隆文库对细菌多样性研究结果的比较  90-92
5 结论与展望  92-95
参考文献  95-104
附录  104-107
  附录一:攻硕期间参与的课题  104
  附录二:载体图谱  104-105
  附录三:DNA分子量标准  105-106
  附录四:缩略语对照表  106
  附录五:发表的文章及获奖情况  106-107
致谢  107-108

白令海北部浮游细菌及表层沉积物细菌的系统发育多样性分析

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