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长期施肥对红壤性水稻土细菌多样性的影响

作 者: 王霞
导 师: 吴金水;魏文学
学 校: 华中农业大学
专 业: 环境科学
关键词: 长期施肥 水稻土 细菌多样性 16S rDNA
分类号: X172
类 型: 硕士论文
年 份: 2009年
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内容摘要


随着我国农业生产的发展,化学肥料的施用量不断增加。化肥的大量投入已经成为稻田系统生产力提高的主要限制因子之一,直接影响到我国的粮食安全。不同施肥制度可以导致土壤微生物种群、数量和活性变化,从而影响土壤肥力。土壤微生物中,以细菌的种类和数量最多。通过对土壤细菌多样性的研究,可以揭示不同化学肥料和施用方式对土壤微生物生态的影响规律,加深人们对细菌和所处土壤环境间相互关系的理解和认识。本研究以连续17年长期施肥制度的稻田土为研究对象,所采土样来自中国科学院桃源农业生态试验站,试验共设4个处理:(1)CK(不施肥);(2)N(单施尿素);(3)NPK(施尿素、过磷酸钙和氯化钾);(4)NPKOM(在施NPK的基础上加紫云英和稻草还田)。应用16S rDNA克隆文库技术直接提取土壤微生物总DNA,分别构建细菌16S rDNA克隆文库,并开展DNA序列测定,然后进行系统发育分析。系统发育树表明427个基因型分别属于11个细菌类群:变形细菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、厚壁菌门(Firmicutes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、放线菌门(Actinobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、绿菌门(Chlorobi)。它们在克隆文库中所占比例分别为49.8%、19.3%、9.8%、7.0%、3.8%、1.6%、1.3%、1.3%、1.2%、0.8%、0.7%。此外,还有10个基因型与已知类群相似性较低,在GenBank数据库中未找到与其相似的已知细菌序列,为非确定序列。通过香农指数(Shannon-Wiener Index)反映物种的多样性,Pielou均匀度指数揭示物种的丰富度。不同施肥处理的多样性指数计算结果显示:NPK>N>NPKOM>CK。在四种不同施肥处理的土壤环境中,NPK处理土壤的细菌多样性指数最高,均匀度指数也最高;而CK处理的多样性指数和均匀度指数均最低;N处理和NPKOM处理的均匀度指数相同,而多样性指数N处理的略大于NPKOM处理。施用NPK能增加土壤细菌的多样性,改变细菌群落结构;而在NPK的基础上施用有机质(NPKOM)后可能改变了土壤环境,使某些细菌无法生存或是趋同进化,以致于和NPK相比,其细菌多样性有所下降。使用LIBSHUFF软件的分析结果表明,四个克隆文库之间都有显著性差异,这也说明与CK相比,三种施肥处理均使细菌群落结构发生改变。此外,长期施肥使细菌各个类群的结构产生了明显变化。与其它三个处理相比,施用N肥增加了α-变形细菌、γ-变形细菌、绿弯菌和酸杆菌的多样性,减少了δ-变形细菌、硝化螺旋菌和厚壁菌的多样性;与CK相比,施用NPK和施用NPKOM增加了δ-变形细菌、厚壁菌和浮霉菌的多样性;与施用NPK相比,施用NPKOM增加了α-变形细菌和硝化螺旋菌的多样性,减少了β-变形细菌、绿弯菌和疣微菌的多样性。总的来说,施肥对稻田土壤细菌群落结构和多样性产生了显著影响。

全文目录


摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
1 前言  11-24
  1.1 研究背景  11
  1.2 文献综述  11-22
    1.2.1 土壤微生物的多样性及其重要性  11-12
    1.2.2 土壤微生物多样性的影响因素  12-17
      1.2.2.1 土壤理化性质  12-13
      1.2.2.2 植被类型  13-14
      1.2.2.3 土壤类型  14
      1.2.2.4 农田管理制度等  14-17
    1.2.3 土壤微生物多样性的研究方法  17-22
      1.2.3.1 微生物平板培养方法  17-18
      1.2.3.2 BIOLOG微平板方法  18
      1.2.3.3 磷脂脂肪酸图谱法/甲基脂肪酸图谱法  18-19
      1.2.3.4 克隆文库分析法  19
      1.2.3.5 扩增16S rDNA限制性酶切片段分析  19-20
      1.2.3.6 末端限制性片段长度多态性分析  20
      1.2.3.7 变性梯度凝胶电泳  20
      1.2.3.8 荧光原位杂交  20-21
      1.2.3.9 DNA微阵列芯片技术  21-22
  1.3 研究目的与意义  22-23
  1.4 技术路线  23-24
2 材料与方法  24-31
  2.1 主要试剂  24-25
    2.1.1 土壤DNA提取所用试剂  24
    2.1.2 其它试剂  24-25
  2.2 主要仪器设备  25
  2.3 分析软件  25
  2.4 实验方法  25-31
    2.4.1 土壤样品的采集  25-26
    2.4.2 土壤理化性质的测定  26
    2.4.3 土壤样品总DNA的提取  26-27
    2.4.4 土壤细菌16S rDNA片段的扩增  27
    2.4.5 PCR产物的纯化  27-28
    2.4.6 连接反应  28
    2.4.7 感受态细胞E.coll DH5α的制备  28
    2.4.8 转化  28-29
    2.4.9 菌落PCR  29
    2.4.10 序列测定  29
    2.4.11 序列分析  29
    2.4.12 统计分析  29-30
    2.4.13 核苷酸序列登录号  30-31
3 结果与分析  31-48
  3.1 土壤样品基本理化性质分析  31
  3.2 土壤微生物总DNA的提取  31-32
  3.3 土壤细菌16S rDNA片段的扩增  32
  3.4 土壤细菌16S rDNA克隆文库的构建  32-33
  3.5 土壤细菌16S rDNA多样性分析  33-35
  3.6 土壤细菌16S rDNA系统发育分析  35-47
    3.6.1 变形细菌  35-44
    3.6.2 酸杆菌  44
    3.6.3 疣微菌门  44-45
    3.6.4 厚壁菌门  45-46
    3.6.5 绿弯菌门  46-47
    3.6.6 芽单胞菌门、放线菌门和浮霉菌门  47
    3.6.7 拟杆菌门、绿菌门、硝化螺旋菌门和未知菌群  47
  3.7 细菌16S rDNA克隆文库之间的比较  47-48
4 讨论  48-51
  4.1 稻田土壤细菌多样性和群落结构  48-49
  4.2 不同施肥处理的稻田土壤细菌多样性指数比较  49-50
  4.3 施肥对稻田土壤细菌群落系统发育多样性的影响  50-51
  4.4 细菌16S rDNA片段克隆文库的构建  51
5 结论  51-53
参考文献  53-62
致谢  62-63
作者简介  63
硕士阶段发表论文  63

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中图分类: > 环境科学、安全科学 > 环境科学基础理论 > 环境生物学 > 环境微生物学
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