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长期施肥对红壤性水稻土细菌多样性的影响
作 者: 王霞
导 师: 吴金水;魏文学
学 校: 华中农业大学
专 业: 环境科学
关键词: 长期施肥 水稻土 细菌多样性 16S rDNA
分类号: X172
类 型: 硕士论文
年 份: 2009年
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内容摘要
随着我国农业生产的发展,化学肥料的施用量不断增加。化肥的大量投入已经成为稻田系统生产力提高的主要限制因子之一,直接影响到我国的粮食安全。不同施肥制度可以导致土壤微生物种群、数量和活性变化,从而影响土壤肥力。土壤微生物中,以细菌的种类和数量最多。通过对土壤细菌多样性的研究,可以揭示不同化学肥料和施用方式对土壤微生物生态的影响规律,加深人们对细菌和所处土壤环境间相互关系的理解和认识。本研究以连续17年长期施肥制度的稻田土为研究对象,所采土样来自中国科学院桃源农业生态试验站,试验共设4个处理:(1)CK(不施肥);(2)N(单施尿素);(3)NPK(施尿素、过磷酸钙和氯化钾);(4)NPKOM(在施NPK的基础上加紫云英和稻草还田)。应用16S rDNA克隆文库技术直接提取土壤微生物总DNA,分别构建细菌16S rDNA克隆文库,并开展DNA序列测定,然后进行系统发育分析。系统发育树表明427个基因型分别属于11个细菌类群:变形细菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、厚壁菌门(Firmicutes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、放线菌门(Actinobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、绿菌门(Chlorobi)。它们在克隆文库中所占比例分别为49.8%、19.3%、9.8%、7.0%、3.8%、1.6%、1.3%、1.3%、1.2%、0.8%、0.7%。此外,还有10个基因型与已知类群相似性较低,在GenBank数据库中未找到与其相似的已知细菌序列,为非确定序列。通过香农指数(Shannon-Wiener Index)反映物种的多样性,Pielou均匀度指数揭示物种的丰富度。不同施肥处理的多样性指数计算结果显示:NPK>N>NPKOM>CK。在四种不同施肥处理的土壤环境中,NPK处理土壤的细菌多样性指数最高,均匀度指数也最高;而CK处理的多样性指数和均匀度指数均最低;N处理和NPKOM处理的均匀度指数相同,而多样性指数N处理的略大于NPKOM处理。施用NPK能增加土壤细菌的多样性,改变细菌群落结构;而在NPK的基础上施用有机质(NPKOM)后可能改变了土壤环境,使某些细菌无法生存或是趋同进化,以致于和NPK相比,其细菌多样性有所下降。使用LIBSHUFF软件的分析结果表明,四个克隆文库之间都有显著性差异,这也说明与CK相比,三种施肥处理均使细菌群落结构发生改变。此外,长期施肥使细菌各个类群的结构产生了明显变化。与其它三个处理相比,施用N肥增加了α-变形细菌、γ-变形细菌、绿弯菌和酸杆菌的多样性,减少了δ-变形细菌、硝化螺旋菌和厚壁菌的多样性;与CK相比,施用NPK和施用NPKOM增加了δ-变形细菌、厚壁菌和浮霉菌的多样性;与施用NPK相比,施用NPKOM增加了α-变形细菌和硝化螺旋菌的多样性,减少了β-变形细菌、绿弯菌和疣微菌的多样性。总的来说,施肥对稻田土壤细菌群落结构和多样性产生了显著影响。
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全文目录
摘要 7-9 ABSTRACT 9-11 1 前言 11-24 1.1 研究背景 11 1.2 文献综述 11-22 1.2.1 土壤微生物的多样性及其重要性 11-12 1.2.2 土壤微生物多样性的影响因素 12-17 1.2.2.1 土壤理化性质 12-13 1.2.2.2 植被类型 13-14 1.2.2.3 土壤类型 14 1.2.2.4 农田管理制度等 14-17 1.2.3 土壤微生物多样性的研究方法 17-22 1.2.3.1 微生物平板培养方法 17-18 1.2.3.2 BIOLOG微平板方法 18 1.2.3.3 磷脂脂肪酸图谱法/甲基脂肪酸图谱法 18-19 1.2.3.4 克隆文库分析法 19 1.2.3.5 扩增16S rDNA限制性酶切片段分析 19-20 1.2.3.6 末端限制性片段长度多态性分析 20 1.2.3.7 变性梯度凝胶电泳 20 1.2.3.8 荧光原位杂交 20-21 1.2.3.9 DNA微阵列芯片技术 21-22 1.3 研究目的与意义 22-23 1.4 技术路线 23-24 2 材料与方法 24-31 2.1 主要试剂 24-25 2.1.1 土壤DNA提取所用试剂 24 2.1.2 其它试剂 24-25 2.2 主要仪器设备 25 2.3 分析软件 25 2.4 实验方法 25-31 2.4.1 土壤样品的采集 25-26 2.4.2 土壤理化性质的测定 26 2.4.3 土壤样品总DNA的提取 26-27 2.4.4 土壤细菌16S rDNA片段的扩增 27 2.4.5 PCR产物的纯化 27-28 2.4.6 连接反应 28 2.4.7 感受态细胞E.coll DH5α的制备 28 2.4.8 转化 28-29 2.4.9 菌落PCR 29 2.4.10 序列测定 29 2.4.11 序列分析 29 2.4.12 统计分析 29-30 2.4.13 核苷酸序列登录号 30-31 3 结果与分析 31-48 3.1 土壤样品基本理化性质分析 31 3.2 土壤微生物总DNA的提取 31-32 3.3 土壤细菌16S rDNA片段的扩增 32 3.4 土壤细菌16S rDNA克隆文库的构建 32-33 3.5 土壤细菌16S rDNA多样性分析 33-35 3.6 土壤细菌16S rDNA系统发育分析 35-47 3.6.1 变形细菌 35-44 3.6.2 酸杆菌 44 3.6.3 疣微菌门 44-45 3.6.4 厚壁菌门 45-46 3.6.5 绿弯菌门 46-47 3.6.6 芽单胞菌门、放线菌门和浮霉菌门 47 3.6.7 拟杆菌门、绿菌门、硝化螺旋菌门和未知菌群 47 3.7 细菌16S rDNA克隆文库之间的比较 47-48 4 讨论 48-51 4.1 稻田土壤细菌多样性和群落结构 48-49 4.2 不同施肥处理的稻田土壤细菌多样性指数比较 49-50 4.3 施肥对稻田土壤细菌群落系统发育多样性的影响 50-51 4.4 细菌16S rDNA片段克隆文库的构建 51 5 结论 51-53 参考文献 53-62 致谢 62-63 作者简介 63 硕士阶段发表论文 63
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中图分类: > 环境科学、安全科学 > 环境科学基础理论 > 环境生物学 > 环境微生物学
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