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氯碘羟喹对沙土鼠全脑缺血再灌注后锌离子致神经元死亡的保护作用及其机制

作　者: 周佳敏
导　师: 王占友
学　校: 中国医科大学
专　业: 人体解剖与组织胚胎学
关键词: 锌氯碘羟喹(CQ) 沙土鼠脑缺血神经保护金属自显影技术 TSQ荧光 Nissl染色 TUNEL染色原位杂交免疫印迹
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

前言金属锌是人体内含量第二位的过渡金属元素,也是正常生长发育、基因表达、蛋白质代谢、免疫功能等过程中所必需的元素。在啮齿类动物中,短暂的全脑缺血可以使海马CA1区的锥体细胞出现延迟性神经元死亡。有证据显示大脑局部缺血中风的大鼠皮层中出现了锌离子从突触前神经元“涌入”突触后神经元的现象。在短暂全脑缺血后神经元轴突终末释放的过量锌离子可能是导致脑选择性延迟神经元死亡的重要原因之一。许多研究表明在缺血动物模型体内注射锌离子螯合剂对缺血所致的神经功能障碍有保护作用。例如,在全脑缺血模型中给予锌离子螯合剂Ca-EDTA可以显著的减少神经元死亡,在蒙古沙土鼠全脑缺血模型给予Ca-EDTA可以减轻CA1区神经元的损伤。氯碘羟喹(Clioquinol,CQ,5-氯-7-碘-8-羟喹,分子量:305.5)是一种具有膜通透性和疏水性的锌离子螯合剂,能穿过血脑屏障。本研究通过制作沙土鼠全脑缺血模型并给予CQ,探讨CQ对海马CA1区锥体细胞的保护作用及其机理。材料与方法一、实验动物及分组健康成年2月龄蒙古沙土鼠随机分为3组:(1)假手术对照组;(2)脑缺血溶剂对照组(1d,3d,7d);(3)脑缺血CQ治疗组(1d,3d,7d)。二甲基亚砜(DMSO)作为CQ的溶剂。为了验证CQ有螯合锌离子的作用,正常2月龄沙土鼠随机分为两组:(1)正常组;(2)注射CQ2小时组。用硒化锌金属自显影(autometallography,AMG)法检测CQ对锌离子的螯合作用。二、沙土鼠全脑缺血模型的建立沙土鼠用4%戊巴比妥钠麻醉(40mg/kg,ip),颈部正中切口游离迷走神经纤维暴露双侧颈总动脉,用无创动脉夹阻断双侧颈总动脉(假手术对照组不夹闭),造成全脑缺血,夹持10min后松开动脉夹,见双侧颈总动脉血液充盈,双侧颈总动脉重新恢复供血。颈部切口用4号尼龙线缝合,酒精消毒。术后沙土鼠在加热灯照射下保温2h直至复苏。脑缺血溶剂对照组在术后立即腹腔注射溶剂DMSO(10mg/kg/day),脑缺血CQ治疗组在术后立即腹腔注射CQ溶液(10mg/kg/day),按照1d,3d,7d的时间点取材。三、检测指标应用硒化锌金属自显影AMG法和TSQ锌离子荧光染色检测CQ螯合锌离子的作用。应用Nissl染色检测脑缺血后溶剂对照组和CO治疗组之间海马CA1区锥体细胞的丢失情况。采用TUNEL染色检测脑缺血3d CQ是否有对脑缺血后CA1区锥体细胞的保护作用。采用原位杂交来检测脑缺血3d各组Caspase-3和Caspase-9的mRNA的表达变化。采用Western Blot来检测在脑缺血1d、3d和7d各组之间Caspase-3和凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor,AIF)的蛋白含量的变化的情况。实验结果一、硒化锌AMG染色结果在注射锌离子螯合剂CQ的正常沙土鼠标本切片中可在整个海马区域见AMG阳性反应与未注射锌离子螯合剂的沙土鼠标本切片相比染色减弱,在齿状回和苔藓纤维处的阳性反应也与未注射锌离子螯合剂CQ沙土鼠切片相比较减弱。二、TSQ锌离子荧光染色结果荧光显微镜下观察,在沙土鼠海马苔藓纤维和齿状回部位脑缺血3d后TSQ荧光染色较假手术对照组增强,而注射了锌离子螯合剂CQ的沙土鼠TSQ荧光染色较假手术组和溶剂对照组相比最弱。三、海马CA1区Nissl染色结果及CA1区神经元计数假手术对照组沙土鼠海马CA1区未见明显神经元损害性改变。脑缺血1d,3d,7d溶剂对照组沙土鼠海马CA1区可见显著的锥体细胞变性、坏死。与溶剂对照组相比,脑缺血1d,3d,7d CQ治疗组海马CA1区锥体细胞死亡数目减少,锥体细胞较排列,形态较完整。四、TUNEL染色结果假手术对照组沙土鼠在海马CA1区仅见少量TUNEL阳性反应细胞;脑缺血3d CQ治疗组沙土鼠海马CA1区锥体细胞内呈深棕色的TUNEL阳性细胞数目明显较溶剂对照组减少。脑缺血3d溶剂对照组海马CA1区TUNEL阳性细胞数与CO治疗组之间比较有显著性差异(P<0.01)。五、Caspase-3和Caspase-9原位杂交染色结果光镜下见Caspase-3和Caspase-9原位杂交阳性反应产物均呈深棕黄色。假手术对照组沙土鼠海马CA1区仅见少量Caspase-3和Caspase-9原位杂交阳性反应细胞。脑缺血3d CQ治疗组沙土鼠海马CA1区锥体细胞内呈深棕黄色的Caspase-3和Caspase-9原位杂交阳性细胞数量明显减少。脑缺血3d溶剂对照组海马CA1区Caspase-3和Caspase-9原位杂交阳性细胞数与CQ治疗组之间比较有显著性差异(P<0.01)。六、Caspase-3和AIF的Western blot结果脑缺血术后1d,3d,7d的溶剂对照组Caspase-3和AIF在动物海马的表达高于CQ治疗组动物。其中Caspase-3(17KD)溶剂对照组和CQ治疗组相比,在1d、3d、7d时间点各组(P<0.01);Procaspase-3(32KD)溶剂对照组和CQ治疗组相比,在1d、7d时间点(P<0.05),在3d时间点(P<0.01);AIF(67KD)溶剂对照组和CQ治疗组相比,在1d时间点(P<0.01),在3d、7d时间点(P<0.05)。结论1、应用AMG染色和TSQ荧光技术证实CQ对锌离子具有螯合作用。2、脑缺血后1d、3d和7d CQ治疗组CA1区锥体细胞数目较溶剂对照组增多。TUNEL染色证实在脑缺血后3d CQ治疗组CA1区锥体细胞TUNEL阳性细胞数目较溶剂对照组减少。3、锌螯合剂CQ通过影响凋亡因子Caspase-3,Caspase-9和AIF的表达和活性,对沙土鼠全脑缺血神经元死亡具有保护作用

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中文论文摘要  5-9
英文论著摘要  9-13
英文缩略语  13-14
论文  14-33
  前言  14-15
  材料与方法  15-20
  结果  20-29
  讨论  29-32
  结论  32-33
本研究创新性的自我评价  33-34
参考文献  34-38
综述  38-48
  参考文献  45-48
致谢  48-49
个人简介  49

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