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苏云金芽胞杆菌Cry1Ac毒素对棉铃虫作用机理的研究

作　者: 田野
导　师: 夏立秋；丁学知
学　校: 湖南师范大学
专　业: 微生物学
关键词: 苏云金芽胞杆菌 Cry1Ac毒素免疫共沉淀受体蛋白病理学
分类号: S476.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是一种分布广泛的革兰阳性细菌,伴随芽胞形成产生杀虫晶体蛋白(Insecticidal crystal proteins,简称ICPs),能够毒杀包括鳞翅目、双翅目、鞘翅目等九个目的500多种昆虫,被广泛应用于害虫防治。棉铃虫是世界性重要农业害虫,随着Bt杀虫剂的广泛使用和转基因棉花的广泛种植,棉铃虫的抗性问题已经成为制约生物Bt农药产业发展的瓶颈,更深入地了解Bt对鳞翅目昆虫的作用机理,对于研究Bt合理使用、制定延缓昆虫抗性发展的策略具有重要意义。本研究以Bt HTX-42(Cry1Ac)为研究菌株,利用液体双相分离法初步提取毒素晶体蛋白,采用等电点沉淀法进行纯化,然后将所得毒素蛋白溶解,最后经凝胶过滤层析,收集280nm紫外吸收峰蛋白样品,SDS-PAGE分析得到高纯度、高浓度的Bt Cry1Ac毒素。本研究以四龄棉铃虫幼虫为供试昆虫,通过差速离心法,成功分离到棉铃虫幼虫中肠刷状缘膜囊(BBMV),采用Bradford法分别对其提取后的组织碎片、离心上清液、离心沉淀中的蛋白含量进行测定,发现大部分蛋白质都存在于提取的中肠BBMV离心沉淀中。利用生物素标记Bt Cry1Ac毒素活化片段,进行体外竞争结合印迹分析,在大约60kDa处明显有一条单一的蛋白条带,增加未经生物素标记的Cry1Ac毒素含量,蛋白条带呈现减弱趋势,毒素与BBMV的结合相对量也不断降低,当未经生物素标记的Cry1Ac毒素含量增加为初始浓度的100倍时,毒素与BBMV的结合相对量由开始的100%下降为20%,相对降低了约80%。表明Cry1Ac毒素相互之间能够发生同源竞争结合,制备的Cry1Ac毒素和棉铃虫中肠BBMV能够用于后续试验,具有较高的生理活性。采用SDS-PAGE和免疫共沉淀技术研究表明,Cry1Ac毒素对棉铃虫中肠BBMV总蛋白量和棉铃虫中肠受体蛋白都产生明显影响。与未饲喂毒素棉铃虫相比较,毒素作用后的棉铃虫中肠小分子量蛋白条带出现丢失,尤其是在蛋白表达量上表现出较大差异,特别是成功分离到一种120kDa的蛋白,经过质谱分析鉴定为氨肽酶APN,并且中肠受体蛋白氨肽酶APN表达量也明显增加。采用Western blot技术研究Cry1Ac毒素寡聚体形成能力,结果表明Cry1Ac毒素在棉铃虫中肠BBMV中能够形成二聚体和四聚体,经过100℃高温处理后毒素寡聚体完全解离为毒素单体。研究Cry1Ac毒素作用前后对棉铃虫幼虫病理学的影响发现,与正常棉铃虫幼虫相比,饲喂毒素的棉铃虫幼虫形态和发育都发生明显变化,利用透射电镜观察发现,苏云金芽胞杆菌Cry1Ac毒素主要影响棉铃虫幼虫中肠细胞微绒毛,导致微绒毛明显变短变粗,顶端出现空泡,随后部分微绒毛发生溶解脱落。

全文目录

中文摘要  3-5
英文摘要  5-10
引言  10-32
  1.苏云金芽胞杆菌的研究进展  10-21
    1.1 苏云金芽胞杆菌的细胞生物学特性  10-15
    1.2 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的作用机理  15-17
    1.3 苏云金芽胞杆菌的应用研究  17-21
  2.昆虫中肠受体的概述  21-27
    2.1 昆虫中肠受体的研究  21-23
    2.2 关于受体氨肽酶  23-25
    2.3 关于受体类钙粘蛋白  25-26
    2.4 关于其它类受体  26-27
  3.昆虫中肠受体与抗性机制的关系  27-30
    3.1 受体氨肽酶和昆虫抗性的关系  27-28
    3.2 受体类钙粘蛋白和昆虫抗性的关系  28-29
    3.3 其它类受体和昆虫抗性的关系  29-30
  4.立题依据和意义  30-32
材料与方法  32-42
  1.材料  32-35
    1.1 菌株  32
    1.2 培养基和培养条件  32
    1.3 供试昆虫  32
    1.4 试验试剂  32-35
    1.5 仪器设备  35
  2.方法  35-42
    2.1 CrylAc毒素的提取、纯化和酶解活化  35-36
    2.2 棉铃虫中肠BBMV的提取  36-37
    2.3 棉铃虫中肠BBMV各组分蛋白含量的定量比较  37-38
    2.4 CrylAc毒素与棉铃虫中肠BBMV体外竞争结合印迹试验  38
    2.5 棉铃虫中肠BBMV总蛋白电泳试验  38
    2.6 CrylAc受体蛋白免疫共沉淀  38-39
    2.7 目的蛋白的原位酶解和质谱鉴定  39-40
    2.8 氨肽酶APN表面电势预测  40
    2.9 CrylAc毒素寡聚体形成能力试验  40-41
    2.10 CrylAc毒素对四龄棉铃虫幼虫虫体病理学影响试验  41
    2.11 透射电镜超薄切片的制备  41
    2.12 生测  41-42
结果与分析  42-56
  1.CrylAc毒素的酶解活化和纯化  42-44
  2.棉铃虫中肠BBMV各组分的蛋白含量分析  44-45
  3.CrylAc毒素与棉铃虫中肠BBMV体外竞争结合印迹分析  45-47
  4.棉铃虫中肠BBMV总蛋白电泳分析  47
  5.CrylAc受体蛋白免疫共沉淀分析  47-52
  6.CrylAc毒素寡聚体形成能力分析  52-53
  7.Bt CrylAc毒素对四龄棉铃虫幼虫病理学影响  53-55
  8.Bt HTX-42晶体蛋白的生物活性测定  55-56
讨论  56-60
  1.BtCrylAc毒素和棉铃虫幼虫中肠BBMV提取方法的探讨  56-57
  2.BtCrylAc毒素对棉铃虫中肠BBMV总蛋白和受体蛋白的影响  57-58
  3.BtCrylAc毒素寡聚体形成能力的探讨  58
  4.BtCrylAc毒素对棉铃虫中肠病理学影响  58
  5.BtCrylAc毒素杀虫机理的探讨  58-60
结论  60-62
参考文献  62-76
附录  76-78
  硕士期间撰写、发表与课题相关学术论文  76-77
  本论文感谢以下项目的资助  77-78
致谢  78-80

苏云金芽胞杆菌Cry1Ac毒素对棉铃虫作用机理的研究

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