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EB病毒早期基因BHRF1转基因模型鼠的建立

作　者: 李欣
导　师: 罗兵
学　校: 青岛大学
专　业: 病原生物学
关键词: 爱波斯坦-巴尔病毒 BHRF1 转基因小鼠 显微注射
分类号: R730.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 32次
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内容摘要


EBV早期基因BHRF1是近年来确认的一种新的EBV致癌基因,体外可引起细胞转化,可能代替LMP1在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。EBV只感染人及高等灵长类动物,缺乏合适的体外复制增殖体系,转基因小鼠能很好地模拟体内的生理、病理环境,因此建立BHRF1转基因小鼠有助于整体水平明确BHRF1抗凋亡机制以及与bcl-2功能的异同,为深入研究BHRF1的生物学特性以及探讨EBV致瘤机制提供理想的动物模型。目的构建稳定表达BHRF1蛋白的重组载体,通过显微注射法建立EB病毒早期基因BHRF1转基因模型鼠。方法①.培养淋巴瘤细胞系B95-8细胞,TRIzol法提取其RNA,反转录合成cDNA,作为PCR模板;采用Primer premier 5.0软件设计BHRF1基因的特异性引物,且在上下游引物的5’端分别引入EcoRⅠ和EcoRⅤ双酶切位点及保护碱基,应用RT-PCR扩增BHRF1基因。②.将目的基因BHRF1与pMD18-T载体连接,构建成pMD18-T-BHRF1。③.分别用EcoRⅠ和EcoRⅤ双酶切pMD18-T-BHRF1和pcDNA(TM)3.1(+)载体,切取目的基因BHRF1和pcDNA3.1(+)连接,构建pcDNA3.1-BHRF1重组载体。④.用NruⅠ和DraⅢ双酶切pcDNA3.1-BHRF1,酶切产物用1%琼脂糖凝胶电泳,然后QIAquick胶回收纯化试剂盒回收含有CMV启动子、插入的目的基因BHRF1及BGHpolyadenylation的DNA片段,然后溶于显微注射缓冲液(pH7.4)中,注射浓度为3ng/μL。⑤.首先结扎雄性小鼠,待恢复后制备假孕小鼠,同时制备供卵小鼠,处死供卵小鼠取受精卵,将含目的基因的DNA片段用显微注射法注入小鼠受精卵原核,进而将导入转基因的受精卵移植至假孕动物输卵管,发育产子鼠。⑥.提取首建转基因小鼠鼠尾组织DNA,PCR鉴定有无目的基因的整合。结果①.RT-PCR扩增获得699bp的BHRF1目的基因片段,并与pcDNA3.1质粒载体连接,经PCR检测、限制性内切酶鉴定以及测序证实目的基因BHRF1正确插入pcDNA3.1质粒载体,成功构建重组质粒pcDNA3.1-BHRF1。②.NruⅠ和DraⅢ双酶切重组质粒pcDNA3.1-BHRF1,电泳结果可观察到约2000bp的CMV+BHRF1+polyA DNA片段以及约4100bp载体片段,将CMV+BHRF1+polyADNA片段回收纯化,用于显微注射。③.选择超排小鼠数20只,见栓数量18只,选取健康受精卵480枚,通过显微注射的方法,将纯化的CMV+BHRF1+polyADNA片段分别注射入480枚小鼠受精卵,短暂培养后390枚受精卵仍健康,移入14只假孕母鼠输卵管内,11只怀孕,产下74只子鼠。④.PCR检测鼠尾组织DNA获得16只阳性首建鼠,阳性率为21.6%(16/74)。结论本实验首次建立了BHRF1转基因首建鼠,有望为进一步研究EBV早期基因BHRF1的生物学特性、深入探讨BHRF1在EBV相关肿瘤发生发展的作用提供了理想的动物模型。

全文目录


摘要  2-4
abstract  4-9
引言  9-10
第一章 材料与方法  10-28
  1.1.仪器、试剂和材料  10-12
    1.1.1 主要仪器  10
    1.1.2 主要试剂和材料  10-11
    1.1.3 常用试剂配制  11-12
  1.2.实验动物的选择  12
  1.3.载体的选择  12-14
    1.3.1 质粒载体的选择  12-13
    1.3.2 T载体的选择  13-14
  1.4.BHRF1基因的克隆  14-15
    1.4.1 BHRF1引物设计  14
    1.4.2 B95-8细胞RNA的提取  14-15
    1.4.3 RT-PCR扩增BHRF1基因扩增  15
  1.5.pMD18-T-BHRF1的制备  15-17
    1.5.1 BHRF1与pMD18-T载体连接  15-16
    1.5.2 BHRF1与pMD18-T连接产物的转化及阳性克隆筛选  16
    1.5.3 pMD18-T-BHRF1的PCR鉴定  16
    1.5.4 pMD18-T-BHRF1的酶切鉴定  16-17
    1.5.5 pMD18-T-BHRF1的测序鉴定  17
  1.6.pcDNA3.1-BHRF1重组质粒的制备  17-18
    1.6.1 BHRF1与pcDNA3.1质粒载体连接  17-18
    1.6.2 pcDNA3.1-BHRF1连接产物的转化及阳性克隆筛选  18
    1.6.3 pcDNA3.1-BHRF1重组质粒的PCR鉴定  18
    1.6.4 pcDNA3.1-BHRF1重组质粒的酶切鉴定  18
    1.6.5 pcDNA3.1-BHRF1重组质粒的测序鉴定  18
  1.7.大量制备pcDNA3.1-BHRF1重组质粒  18
  1.8.pcDNA3.1-BHRF1重组质粒酶切及溶解  18-20
  1.9.供体小鼠的准备及显微注射  20-25
    1.9.1 雄鼠的结扎  21
    1.9.2 超排小鼠的准备  21-22
    1.9.3 采集受精卵  22
    1.9.4 显微注射  22-25
  1.10.受精卵的输卵管移植  25-27
    1.10.1 取出输卵管  25-26
    1.10.2 准备移植胚胎  26
    1.10.3 移植前对胚胎的鉴定  26
    1.10.4 输卵管移植  26-27
    1.10.5 复苏  27
  1.11.首建鼠PCR鉴定  27-28
    1.11.1 鼠尾DNA提取  27
    1.11.2 首建鼠DNA PCR检测  27-28
第二章 结果  28-34
  2.1 BHRF1基因扩增及重组质粒构建  28-32
    2.1.1 RT-PCR扩增BHRF1基因  28
    2.1.2 pMD18-T-BHRF1载体的酶切鉴定  28-29
    2.1.3 pMD18-T-BHRF1载体的测序结果  29
    2.1.4 pcDNA3.1-BHRF1重组质粒的构建  29-30
    2.1.5 pcDNA3.1-BHRF1重组质粒的测序结果  30-32
    2.1.6 显微注射DNA片段的制备  32
  2.2 显微注射和胚胎移植  32
  2.3 PCR检测  32-34
第三章 讨论  34-42
  3.1 EBV早期基因BHRF1的研究  34-36
    3.1.1 BHRF1基因及BHRF1蛋白的结构  34-35
    3.1.2 BHRF1与Bcl-2的同源性  35
    3.1.3 EBV早期基因BHRF1的功能  35-36
  3.2 转基因小鼠基本原理  36-37
  3.3 影响基因转移效率的因素  37-40
    3.3.1 DNA的结构与纯度  38
    3.3.2 溶解DNA的缓冲液与DNA的浓度  38
    3.3.3 显微注射和受精卵移植  38-40
  3.4 关于目的基因的整合及检测  40-42
第四章 结论  42-43
参考文献  43-45
综述  45-67
  综述参考文献  63-67
攻读学位期间的研究成果  67-68
致谢  68-70

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 一般性问题 > 肿瘤病理学、病因学
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