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目的:骨髓间充质干细胞体外分离、培养和扩增技术在实验阶段已经成熟并且在临床部分已经开始应用,但是尚未能找到其合适的载体,不便于临床的实际应用。为提高骨髓间充质干细胞在临床应用的疗效,实验拟比自固化磷酸钙人工骨松质骨颗粒和自体松质骨作为载体对实验性家兔股骨头缺血性坏死的修复作用。方法:1.实验前准备及实验动物的分组:实验动物提前一周饲养以适应环境及观察确定无疾病。术前一天禁食水。24只成年新西兰大耳白兔,随机分为A、B两组,每组12只,A组为自固化磷酸钙人工骨(Calcium Phosphate Cement, CPC )松质骨颗粒(CCPC)联合骨髓间充质干细胞( bone marrow mesenchymal stem cells ,BMSCs)移植组,B组为自体松质骨联合BMSCs移植组。两组于术后2,4,6,8周各处死3只实验动物。2. BMSCs获取培养及复合载体:术前1周从成年新西兰大耳白兔髂后上嵴处抽取骨髓,种植于6孔细胞培养板内,培养液为含20%胎牛血清DMEM液,放入细胞培养箱内培养,传代密度为1×106/cm2。第3代细胞培养至传代密度时制成细胞悬液, A组分别浸润每个4mm×4mm×4mm大小CCPC,放入细胞培养箱内培养,24小时后手术植入实验动物股骨头钻孔处;B组则分别浸润分成和CCPC一样大小的明胶海绵颗粒,放入细胞培养箱内培养24小时后,手术将松质骨颗粒和载有BMSCs的明胶海绵均匀混合并植入实验动物股骨头钻孔处。3.实验动物模型制备及手术方法:所有动物双侧股骨头都参加实验。取俯卧位,40mg/kg硫喷妥钠腹腔注射麻醉。常规消毒,铺单。髋关节后侧切口,显露股骨头,不切断圆韧带,髋关节不脱位,保护周围组织,用液氮棉团连续冷冻股骨头3分钟造成股骨头坏死模型。自然复温后从股骨颈内后侧向股骨头内钻孔,用直径3.5mm钻头向股骨头内钻入4mm,到达关节软骨下。A组钻孔后植入复合BMSCs的CCPC,关闭伤口。B组钻孔后植入复合BMSCs的明胶海绵混合自体松质骨颗粒,关闭伤口。4. HE染色:取出I0%福尔马林中保存的股骨头标本,从股骨颈基底锯断,将标本做标记后放入8%甲酸溶液中换液三次,共脱钙两周。脱水、透明、浸蜡、修块,做5μm切片,水浴,铺片,烤片。然后行HE染色:熔蜡,酒精梯度水化,亚甲兰染色,酸化,返兰,伊红染色,再酒精梯度脱水,透明。然后光学树脂封片。5. X线及组织学观察:X射线观察钻孔区骨密度及骨小梁的变化情况。苏木精-伊红染色切片,光镜观察钻孔区细胞及骨小梁的变化情况。6.统计学方法:采用SPSS 11.5统计学软件,对缺损区新生骨小梁图像,进行面积百分比均值的t检验分析。结果:1.股骨头X线检查:A组2周标本,钻孔区可见股骨头中部植入复合BMSCs的CCPC部位有明显的高密度区,骨小梁结构完整。4周标本,钻孔区高密度部分密度略减,钻孔区以外密度有所增加,骨小梁结构完整。6周标本,内植CCPC部分密度仍略高,出现骨小梁,钻孔区界限模糊,钻孔缺损区以外密度有所增加,骨小梁紊乱,8周标本,内植CCPC部分密度基本正常,出现骨小梁,钻孔区界限进一步模糊。钻孔缺损区以外密度有所增加,骨小梁紊乱,出现软骨下囊性变。B组2周标本钻孔区密度减低,钻孔区以外密度有所增加,骨小梁结构完整。4周标本,钻孔区密度增高但仍低于正常,钻孔区以外密度有所增加,骨小梁结构完整。6周标本,钻孔区可见稀疏骨小梁,钻孔区以外密度增加,骨小梁紊乱,出现软骨下囊性变。8周标本,钻孔区密度基本正常,出现骨小梁,钻孔区界限模糊。钻孔区以外密度有所增加,骨小梁紊乱,出现软骨下囊性变。从总体上看, A组缺损区因植入完整的CCPC,故密度逐渐降低最后出现正常骨小梁结构。B组缺损区植入明胶海绵混合自体松质骨颗粒,密度由开始降低后升高,最后出现正常骨小梁结构。2.股骨头的组织检查:A组术后2周时,钻孔缺损区内有大量的成骨细胞,缺损区边缘有较多的类骨质和新生骨小梁。4周时缺损区内有大量骨小梁形成及类骨质填充。6周时缺损区内可见比较成熟的骨小梁,并出现骨髓组织。在8周时缺损区内骨小梁趋于成熟,并有大量骨髓组织形成。B组实验动物的股骨头标本术后2周时,钻孔边缘形成较多新生骨组织,新生骨内侧有一个成骨细胞聚集层,而钻孔区中心充满了炎症细胞。4周时,钻空区新生骨小梁增多,但并不在全部区域,部分标本在钻孔中央形成少量骨组织,部分标本无骨组织形成。6周时现象与4周的情况接近,只是骨小梁稍加成熟,有骨髓组织出现。钻孔区有血管出现。8周时钻孔边缘区充满分布不均匀的骨小梁组织和骨髓组织。统计学分析:在术后8周时,两组实验动物股骨头钻孔缺损区内,骨小梁的面积百分比值分别为,A组为0.804650±0.0022681,B组为0.801267±0.0040373,经过统计学分析表明,具备方差齐性,总体无差别,两两比较P=0.842>0.05,无统计学意义。结论:1. BMSCs复合CCPC有很好的成骨作用,无细胞诱导因子亦可良好成骨;2. BMSCs复合CCPC修复股骨头坏死效果等同于其复合自体松质骨;3. CCPC可以作为BMSCs良好的支架材料。
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