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玉米大斑病菌MAPK级联途径中STK1基因的功能研究

作　者: 李坡
导　师: 董金皋
学　校: 河北农业大学
专　业: 植物学
关键词: 玉米大斑病菌 MAPK STK1基因渗透调节钠胁迫
分类号: S435.131
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 73次
引　用: 4次
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内容摘要

由玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)引起的玉米大斑病是威胁玉米生产安全的重要病害之一,常造成严重经济损失。研究表明,许多植物病原真菌的生长、发育及致病性都受到细胞信号转导途径的调控,其中MAPK信号转导途径是普遍存在的并有重要调控作用的信号转导途径。玉米大斑病菌中的STK1基因是编码MAPK信号途径中MAP kinase一个基因,本实验室前期研究发现该基因与大斑病菌的致病性和分生孢子萌发有关,但该基因参与玉米大斑病菌渗透调节的具体作用尚不明确。本试验在克隆STK1基因的基础上,对其进行了生物信息学的分析,发现它与其他真菌的渗透调节相关的MAP kinase基因具有很高的同源性。为了进一步明确该基因的功能,本实验采用功能互补的方法,构建了酿酒酵母胞内表达载体,使该基因在酿酒酵母HOG1基因缺失突变体中表达,以进一步明确STK1基因的功能。主要结果如下:1.获得了STK1基因全长序列,并最终确定一个全长为1071 bp的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)。对STK1基因的开放阅读框进行了生物信息学分析,利用相关软件对该基因进行翻译,发现该基因编码356个氨基酸的蛋白。经对该基因的预测蛋白进行同源性分析,发现预测蛋白与许多植物病原真菌渗透调节相关的MAP kinase都有90%以上的同源性;通过比对发现,该蛋白与这些真菌中MAP kinase相似,含有渗透胁迫相关的MAP kinase所具有的保守结构域:TGY motif、CD domain、BD domain。其中,171～173位的TGY motif是渗透相关的MAP kinase的典型特征,CD domain和BD domain是MAP kinase上游调节物和下游效应物的结合和催化部位;聚类分析将不同的MAP kinase分为3个不同的类群,即Hog1、Fus3/Kss1和Slt2,其中Stk1与Hog1类群聚类在一起。2.构建了酿酒酵母表达载体pVT102U-STK1,进而以该重组质粒转化酿酒酵母HOG1基因缺失突变体,通过酿酒酵母相关的氨基酸合成缺陷筛选及PCR验证获得了阳性转化子。3.对获得的转化子进行了多种胁迫处理,发现在盐胁迫下该基因能够恢复酿酒酵母HOG1缺失突变体对盐的敏感性,并能恢复其异常的的细胞形态至正常的表型。并能恢复HOG1缺失突变体对氧胁迫的敏感性,说明STK1基因具有抵抗氧胁迫的的作用。4.研究发现,STK1基因不仅能够抵抗各种盐胁迫,其转化子在钠盐胁迫下的生长速度及胞内甘油的累积高于野生型,说明该基因对钠胁迫的耐受力更强。由于盐碱土壤中钠盐为主要的盐类,所以我们希望该基因能够尽早转入到植物体内来提高植物的抗盐能力,从而为大量废弃盐碱土壤的利用提供遗传资源。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-10
1 引言  10-17
2 材料和方法  17-30
  2.1 试验材料  17-18
    2.1.1 供试玉米大斑病菌及酵母菌株  17
    2.1.2 供试载体  17
    2.1.3 供试培养基及溶液  17-18
    2.1.4 供试试剂  18
    2.1.5 主要仪器  18
  2.2 试验方法  18-30
    2.2.1 玉米大斑病菌基因组DNA提取  18-19
    2.2.2 玉米大斑病菌总RNA提取方法及第一链cDNA的合成  19-20
    2.2.3 STK1 cDNA序列的PCR扩增  20
    2.2.4 琼脂糖凝胶电泳检测  20-21
    2.2.5 PCR扩增产物的凝胶回收  21
    2.2.6 PCR扩增产物的克隆测序  21-22
    2.2.7 STK1基因的生物信息学分析  22-23
    2.2.8 酵母表达载体的构建  23-26
    2.2.9 酵母的遗传转化  26-27
    2.2.10 转化子的验证  27
    2.2.11 盐胁迫下酵母梯度生长试验  27-28
    2.2.12 盐胁迫下酵母生长速度的测定  28
    2.2.13 氧胁迫对酿酒酵母存活率的测定  28
    2.2.14 酵母甘油含量的测定  28-30
3 结果与分析  30-44
  3.1 玉米大斑病菌STK1基因的扩增  30-32
    3.1.1 玉米大斑病菌基因组DNA和总RNA的提取及cDNA的合成  30
    3.1.2 引物的设计  30
    3.1.3 STK1基因cDNA的扩增  30-31
    3.1.4 重组载体pMD19-T-STK1的PCR扩增和酶切检测  31-32
  3.2 STK1基因的生物信息学分析  32-36
    3.2.1 STK1基因cDNA全长的测序结果  32-33
    3.2.2 STK1基因编码产物同源性分析及保守结构域分析  33-35
    3.2.3 聚类分析  35-36
  3.3 表达载体的构建  36-39
    3.3.1 表达载体pVT102U的酶切验证  36-37
    3.3.2 STK1基因ORF及表达载体pVT102U的酶切  37
    3.3.3 pVT102U-STK1酵母表达载体的验证  37-39
  3.4 酿酒酵母的遗传转化及转化子的表型分析  39-44
    3.4.1 pVT102U及pVT102U-STK1的遗传转化  39
    3.4.2 转化子的PCR扩增鉴定  39
    3.4.3 酵母转化子的耐盐性  39-41
    3.4.4 STK1基因对钠盐的抵抗力  41-43
    3.4.5 氧胁迫对酵母生长的影响  43-44
4 讨论  44-48
  4.1 MAP kinase的保守结构域  44-45
  4.2 利用酿酒酵母研究基因功能的特点  45-47
  4.3 Stk1的功能及应用展望  47-48
5 结论  48-49
参考文献  49-56
在读期间发表的学术论文  56-57
作者简历  57-58
致谢  58-59
附发表论文  59-74

玉米大斑病菌MAPK级联途径中STK1基因的功能研究

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