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PCR-DGGE对六种淡水鱼类肠道菌群结构的比较研究

作　者: 许振国
导　师: 杨月伟；徐海圣
学　校: 曲阜师范大学
专　业: 动物学
关键词: 淡水鱼肠道菌群肠道结构食性 16S rDNA PCR-DGGE
分类号: S941
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 328次
引　用: 3次
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内容摘要

随着现代集约化和规模化水产养殖业的发展,应激原的增多,导致水产动物免疫力下降,对疾病的易感性大大增强。近年来,人们在养殖水体和水产饲料中施用微生态制剂来改善养殖生态环境,提高水产养殖动物的免疫力,抑制病原微生物的繁殖,从而减少疾病的发生。微生态制剂大都是通过对肠道菌群施加影响而发挥作用的,因此,对动物肠道菌群的了解是研究和开发微生态制剂的先决条件。本文采用16S rDNA PCR-DGGE指纹图谱技术比较分析集约化养殖的健康鳙和鲢、草鱼和团头鲂、黄颡和鳜的肠道优势菌群结构,探讨它们在肠道菌群组成上的差异,亦为澄清淡水鱼肠道微生物区系及开发可定植益生菌奠定基础。首先,本文采用解剖学方法将六种淡水鱼的肠道按照鱼类解剖学特征分为前肠、中肠和后肠三段,然后参照修改后的Hoelzel等的方法进行肠道微生物总DNA提取。其次,本文使用细菌16S rDNA-V3片段的特异性引物进行肠道菌群总DNA的降落式PCR扩增,然后进行变性梯度凝胶电泳。最后,将DGGE图谱中清晰的优势性条带标记后割胶回收,并进行克隆和测序。测序结果BLAST比对后,使用DNAMAN软件构建系统进化树。对六种淡水鱼肠道内的细菌进行DGGE指纹图谱的多样性分析,图谱中的优势性条带表明,淡水鱼类的肠道中存在着大量的细菌群落。分析16S rDNA的基因序列后发现,所得序列与gene bank中序列的相似度在96%-100%之间。对鳙、鲢、草鱼、团头鲂、黄颡、鳜的肠道壁菌群进行分析,研究发现:同种鱼中前肠壁的细菌分布一般比中肠壁和后肠壁少,在同一肠段中都是厌氧菌总数远大于好氧菌总数;不同鱼种之间,肠壁的好氧菌总数差别比厌氧菌总数差别大得多。六种淡水鱼类肠道菌群的种类和数量都具有从前肠至后肠逐渐增多的现象,它们肠道壁中的厌氧菌种类和数量分布的规律是:肉食性的鳜和黄颡＞食浮游动植物为主的鳙和鲢＞草食性的草鱼和团头鲂,即鱼类肠道壁中的厌氧菌总数和双歧杆菌的数目随着其从草食性向肉食性的发展而逐渐增加。乳酸菌是鱼类中肠道菌群的重要组成部分,鱼类肠道的菌群组成结构随着鱼的种类、食性、生长的环境的不同而呈现出差异。结论:1.16S rDNA PCR-DGGE技术是一种快速有效的研究淡水鱼类肠道菌群群落生态的实验技术。2.淡水鱼体内肠菌组成结构随着鱼种类不同而呈现出差异,种类和数量具有从前肠至后肠逐渐增多的现象,并且厌氧菌总数大于好氧菌总数。3.淡水鱼体内肠菌组成与不同的食物来源有关,鱼类肠壁中的厌氧菌总数和双歧杆菌的数目随着其从草食性向肉食性的发展而逐渐增加。4.鱼类肠道内专性厌氧菌以A、B型拟杆菌科等细菌为主,好氧和兼性厌氧细菌则以气单胞菌属、肠杆菌科等细菌为主,在淡水鱼肠道中气单胞菌及肠杆菌为优势菌群。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-9
第一章前言  9-17
  1.1 研究背景  9-14
    1.1.1 概述  9
    1.1.2 鱼类的肠道结构  9
    1.1.3 鱼肠道正常菌群的形成  9-10
    1.1.4 鱼类肠道菌群的特性、组成及数量  10
    1.1.5 鱼类肠道正常菌群的生理功能  10-12
    1.1.6 影响鱼肠道菌群结构与组成的因素  12-14
    1.1.7 研究鱼类肠道菌群试验动物模型和方法  14
  1.2 本论文的研究目的、意义和内容  14-17
    1.2.1 研究目的和意义  15
    1.2.2 主要研究内容  15-17
第二章淡水鱼肠道菌群的PCR-DGGE分析  17-24
  2.1 实验材料  17-20
    2.1.1 实验动物  17
    2.1.2 主要仪器设备  17
    2.1.3 主要试剂及配制  17-18
    2.1.4 主要工作液配方  18-20
    2.1.5 引物设计  20
  2.2 实验方法  20-24
    2.2.1 肠道样品的制备  20
    2.2.2 肠道微生物总DNA提取  20-21
    2.2.3 细菌16S rDNA-V3片段的PCR扩增  21
    2.2.4 变性梯度凝胶电泳  21-22
    2.2.5 优势条带的回收、克隆和测序  22-23
    2.2.6 构建系统发育树  23-24
第三章实验结果及讨论  24-42
  3.1 实验结果  24-38
    3.1.1 肠道微生物总DNA的提取  24
    3.1.2 肠道微生物16S rDNA-V3片段的PCR扩增  24-25
    3.1.3 变性梯度凝胶电泳(DGGE)  25-29
    3.1.4 细菌16S rDNA特征序列分析  29-35
    3.1.5 系统进化树的构建  35-38
  3.2 讨论  38-41
    3.2.1 肠道结构与肠菌结构的关系  38-39
    3.2.2 鱼类食性与肠菌结构的关系  39
    3.2.3 鱼类肠道菌群的结构分析  39-40
    3.2.4 PCR-DGGE技术存在的缺陷及对策  40-41
  3.3 结论  41-42
参考文献  42-48
附录  48-59
论文发表情况  59-60
致谢  60

PCR-DGGE对六种淡水鱼类肠道菌群结构的比较研究

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