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Noxa基因转染乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制和促凋亡作用

作　者: 赵志
导　师: 吴爱国
学　校: 南方医科大学
专　业: 普通外科学
关键词: Noxa基因乳腺癌转染凋亡
分类号: R737.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

乳腺癌的发生发展是一个多基因、多步骤的演变过程。据资料统计,我国乳腺癌发病率占全身各种恶性肿瘤的7—10%,随着人口城市化的加速,乳腺癌发生率及病死率有逐年上升的趋势,特别在沿海城市,发病率较以前有明显的增长,是严重影响妇女身心健康甚至危及生命的最常见的恶性肿瘤之一。目前,对于乳腺癌的治疗主要为手术切除、诱导肿瘤细胞死亡和凋亡、内分泌治疗；诱导肿瘤细胞死亡和凋亡包括化疗、放疗、和基因治疗。而这些手段近年来已难以取得更大进展,因此从乳腺癌的发病机制着手以寻求新的治疗手段越来越引起人们的关注。近年来,有关肿瘤与细胞凋亡的关系以及从诱导细胞凋亡的机制出发研究新的抗癌方法的报道日益增多。有关细胞凋亡的研究使人们意识到,应以诱导细胞凋亡为新的目标来寻找治疗肿瘤的新途径。有效的抗肿瘤治疗是诱发肿瘤细胞凋亡,而不是抑制肿瘤细胞增殖或使用毒性药物来杀死肿瘤细胞。细胞凋亡是一种程序性细胞死亡,形态学上以细胞核固缩和碎裂、染色体DNA片段化、凋亡小体的形成、完整的细胞膜为特征。在HE染色的组织切片中细胞体积缩小、胞质致密、嗜酸性染色增强,并可形成凋亡小体。在组织中凋亡细胞常以分散单个形式存在,凋亡细胞与周围细胞分离,不引起炎症反应。凋亡是活体细胞清除老化细胞、受损伤细胞、细菌或病毒感染细胞以及肿瘤突变细胞的重要调节手段。大量的证据指出线粒体是细胞凋亡的最有力调节者。一方面,线粒体可以为细胞提高生存所需ATP以及隔离促凋亡蛋白cytochrome c.AIF,二者在凋亡时可释放入细胞质。另一方面,线粒体通过裂变、吞噬周围细胞以改变细胞形态而适应周围环境需要,是细胞形态改变的重要细胞器。在细胞凋亡过程中,线粒体被片段化。而线粒体的整体性受到Bcl—2家族的调节。最近的报道表明,线粒体的活动受到Bax和Bak的调节,这也就说明了Bcl—2家族是线粒体形态的调节者。目前发现在哺乳动物细胞中细胞凋亡主要是通过2种途径,一是由死亡受体介导的外源性途径；二是由Bcl—2家族介导的内源性途径,主要是通过线粒体发挥作用。Bcl—2家族依据Bcl—2同源区域(BH)的不同可以分为三个亚家族：一是含有4个BH域的抗凋亡亚家族,包括Bcl—2、Bcl—xL、Mcl—1、Bcl—w、A1；二是含有多个BH的促凋亡亚家族,包括Bak和Bax。三是含有BH3—only的促凋亡亚家族,只含有1个BH3结构域,包括Bid、Bad、Bim、Puma、Noxa等,是线粒体途径凋亡的发起者。Noxa又称APR(ATL—2 derived PMA—2 responsive gene)或PMAIP1(phorbol—12 myriistate—13—acetate—induced protein1)。于2000年首次被证明Noxa是Bcl—2家族的促凋亡成员,且是p53靶基因之一。人Noxa基因定位于18q21,长1954bp,编码蛋白Noxa长54个氨基酸且含有一个BH域。Noxa作为Bcl—2家族中促凋亡亚家族BH—only中的一员,在体内低表达.Noxa的BH3域与Bcl—2促生存亚家族的Mcl—1和A1的BH3域通过特定结合,从而抑制其抗凋亡活性。Noxa是最重要的凋亡调节因子,一旦被激活,Noxa调节Bax亚家族转位并嵌入到线粒体,导致线粒体膜的通透性增强,使线粒体内的促凋亡因子如细胞色素C释放入细胞质,细胞色素C能与凋亡蛋白酶活化因子(apoptotic protease—activating factor,Apaf21)及caspase29形成复合体(凋亡小体),激活caspase23,启动caspase级联反应,诱导细胞凋亡。众所周知,在基因治疗的研究领域中,关于p53肿瘤抑制基因的研究极为广泛。在人类所有的肿瘤中,已发现有一半以上的肿瘤都存在着p53的突变。而其在抑制肿瘤形成的过程中,诱导肿瘤细胞凋亡被认为是最为重要的机制。当p53被有害的刺激激活时,如DAN损伤、缺氧、致癌基因刺激,p53通过调节可使细胞进入静止期或诱导细胞凋亡。这种微妙的调节在抑制肿瘤形成过程中起着至关重要的作用。通过对p53的这种调节机制的研究得出,细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂(p21WAF1/Cipl)是诱导细胞周期静止的关键,而Bcl一2家族的含有BH—only蛋白的Noxa是诱导细胞凋亡的必备条件。正因为p53的这些功能,p53为恶性肿瘤的基因靶向治疗提供了新的途径。目前,对于恶性肿瘤,如肺癌、乳腺癌和头颈部癌,p53的基因靶向治疗已广泛应用于动物实验和临床应用并且取得了一定的成绩。在以前的临床试验中,瘤内注射带有p53基因的腺病毒载体可以增加肿瘤对化疗和放疗的敏感性并且能使肿瘤体积缩小。Noxa是p53调控的基因,是介导凋亡的关键基因；其上游启动子序列中含p53的结合位点,受到凋亡信号刺激后,p53可直接与其靶位点结合从而促进Noxa转录和蛋白表达。DNA损伤时p53可作为转录因子与Noxa启动子中的p53识别位点结合,激活Noxa转录发挥促凋亡作用。Noxa是p53的下游靶基因,不但可以通过位于Noxa启动子内的共有p53应答组件调节基因表达,而且还可以通过p53非依赖途径诱导基因表达。所以,在外界因素刺激下,如DNA损伤、缺氧等,Noxa可在p53转录依赖与转录非依赖途径诱导细胞凋亡,其在肿瘤发生、治疗中都发挥着非常重要的枢纽作用。人乳腺癌细胞中用腺病毒基因表达系统异位表达Noxa,能使90%的细胞发生凋亡,模拟Noxa的BH3结构域药物同样能促进肿瘤细胞的凋亡。基于Noxa在人体内低表达及目前研究现状,本实验拟将构建好的携带Noxa基因的质粒用脂质体瞬时转染入人MCF—7乳腺癌细胞,使其在细胞内高表达,通过RT—PCR、Western blot检测转染后Noxa基因mRNA及蛋白的表达情况,MTT比色法测定细胞增殖的抑制,流式细胞仪和Hoechst 33342染色检测细胞的凋亡的变化。目的构建pIRES2—EGFP—Noxa质粒,利用脂质体将其瞬时转染入人乳腺癌MCF—7细胞,研究(?)Noxa基因转染入细胞后的mRNA及蛋白的表达,观察其对乳腺癌细MCF—7胞的增殖以对其凋亡的影响,为乳腺癌的基因治疗奠定科学的基础。方法1、构建真核表达载体pIRES2—EGFP—Noxa,利用脂质体LipofectamineTM2000,将pIRES2—EGFP—Noxa转染入人乳腺癌MCF—7细胞；在转染12h、24h后,利用光学显微镜观察细胞膜及细胞核的变化及细胞转染情况；2、实验分为脂质体对照组、阴性质粒组、阳性质粒组,经逆转录多聚酶链反应(RT—PCR)方法检测质粒转染入乳腺癌MCF—7细胞48h后细胞中Noxa基因mRNA的表达；以内参校正灰度值,经one—way ANOVA统计学方法比较各组的差异；3、实验分为脂质体对照组、阴性质粒组、阳性质粒组,Western blot方法检测质粒转染入乳腺癌MCF—7细胞48h后MCF—7细胞中Noxa蛋白的表达；以内参校正灰度值,经one—way ANOVA统计学方法比较各组的差异。4、MTT法检测细胞的增殖情况,实验分为脂质体对照组、阴性质粒组、阳性质粒组,使用脂质体转染质粒入MCF—7细胞,分别设24h、48h、72h三个时间点,加入MTT后分光光度计检测OD值,计算细胞生长抑制率,检测人乳腺癌MCF—7细胞增殖情况；用两因素析因设计方差分析比较各组的差异；5、实验分脂质体对照组、阳性质粒组；用流式细胞仪(FCM)检测转染pIRES2—EGFP—Noxa质粒入乳腺癌MCF—7细胞48h后乳腺癌MCF—7细胞的凋亡情况；结果用统计学方法两独立样本t检验比较差异。6、实验分脂质体对照组、阳性质粒组,Hoechst 33342染色检测转染pIRES2—EGFP—Noxa质粒入人乳腺癌MCF—7细胞48h后对细胞凋亡的影响,结果用统计学方法两独立样本t检验比较差异。结果1、根据pIRES2—EGFP的特点,转染pIRES2—EGFP的细胞可表达EGFP,转染重组载体pIRES2—EGFP—Noxa可表达EGFP—Noxa融合蛋白。转染后各时段在荧光显微镜下观察均可见绿色荧光。转染阴性质粒pIRES2—EGFP的细胞荧光明亮,转染阳性质粒pIRES2—EGFP—Noxa的细胞荧光稍弱；2、转染阳性质粒pIRES2—EGFP—Noxa 48h后,阳性质粒组细胞内Noxa mRNA表达水平(0.605±0.034)高于阴性质粒组(0.295±0.006)和脂质体对照组(0.298±0.028)和,组间的差异具有统计学意义((F=140.209,P<0.01)；Noxa基因经转染后在MCF—7细胞内成功表达,使得阳性组Noxa基因的表达增强,而未转染Noxa的阴性质粒组与脂质体对照组细胞则表达较弱。3、Western blot检测表明在MCF—7细胞中存在分子量11kDa的特异性条带,与Noxa分子量相符,转染pIRES2—EGFP—Noxa阳性质粒组在PVDF膜上的特异性条带明显高于脂质体对照组和阴性质粒组,各组校正灰度平均值为：阳性质粒组(0.493±0.026)、阴性质粒组(0.200±0.097)、脂质体对照组为(0.192±0.088),组间差异具有统计学意义(F=14.568,P<0.01)；Noxa基因经转染后其蛋白的表达量明显上升。而脂质体对照组和阴性质粒组的Noxa蛋白的表达量则较弱。4、MTT结果显示,各时间点的细胞增殖有差异(Ftime=8.842, P<0.05),各处理组的细胞增殖也有差异(Fgroup=58.574, P<0.005),时间和组别有交互效应(F交互=6.669,P<0.05)。在两两比较中,24h的组间抑制率差异无统计学意义(P>0.05),48h与72h的组间抑制率差异有统计学意义(P<0.05)。各处理组中,阳性质粒组三个时间点的抑制率差异有统计学意义(P<0.05)；而阴性质粒组和脂质体对照组各个时间点的抑制率无显著性差异(P>0.05)。在阳性质粒组中,抑制率随时间的延长而上升,其中抑制率最大出现在72h。Noxa基因在乳腺癌MCF—7细胞的高表达可以抑制乳腺癌细胞的生长,且随着时间的延长,其抑制率也逐渐增高。5、流式细胞仪检测得出,Noxa基因在转染后48h阳性质粒组凋亡率(21.02±2.34)%与脂质体对照组凋亡率(3.58±0.76)%相比,差异具有统计学意义(t=—15.843,P<0.05),Noxa基因能够促进细胞凋亡。6、Hoechst 33342染色显示Noxa基因转染后细胞出现凋亡,而脂质体对照组未出现明显的凋亡,阳性质粒组凋亡率为(21.00±3.80)%,与脂质体对照组凋亡率(4.00±2.54)%比较差异有统计学意义(t=—8.295,P<0.05)。Noxa基因转染乳腺癌MCF—7细胞后对其有一定的凋亡诱导作用。结论1、体夕(?)pIRES2—EGFP—Noxa转染入人乳腺癌MCF—7细胞后Noxa mRNA及蛋白的得到成功表达；2.Noxa基因在细胞内的成功表达可抑制人乳腺癌MCF—7细胞的增殖,并促进MCF—7细胞凋亡；3.Noxa(?)基因的增殖抑制和促凋亡作用可能为乳腺癌的基因治疗提供一个新的研究方向。

Noxa基因转染乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制和促凋亡作用

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