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Bacillus smithii产耐热菊粉酶的分离纯化及其化学修饰

作　者: 刘彬
导　师: 王静云
学　校: 大连理工大学
专　业: 生物化工
关键词: Bacillus smithii 耐热菊粉酶 酶纯化 化学修饰 酶活中心
分类号: TQ925
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 85次
引　用: 1次
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内容摘要


本文对实验室筛选的两株高产耐热菊粉酶的Bacillus smithii菌株,优化条件下进行产酶发酵,分离纯化得到耐热菊粉酶,研究其酶学性质,应用化学修饰的方法表征影响耐热菊粉酶活性的关键氨基酸组成,探讨其催化作用机理和耐热机制。优化培养Bacillus smithii T4,离心收集发酵上清液,通过硫酸铵分级沉淀、透析脱盐、Sepharose Q-FF、DEAE-Sepharose CL-6B离子交换层析和Superdex 75凝胶过滤层析得到纯化的菊粉酶,SDS-PAGE检测为单一条带,亚基分子量约为45.5KD,比酶活为881.6 IU/mg。酶学性质研究表明:该酶催化作用的最适温度为60℃,60℃和70℃的半衰期分别为8h和5h;最适pH为5.0,在pH4.5-7稳定性较好;以菊粉为底物时,米氏常数Km值为2.73mmol/L,没有转化酶活性,表明来源Bacillus smithii T4菊粉酶的底物专一性较好。而来源于Bacillus smithii T7耐热菊粉酶,比来源于Bacillus smithii T4菊粉酶催化效率高,比酶活可达1283.9 IU/mg,而且耐热性能更好。采用化学修饰法研究Bacillus smithii T7产耐热菊粉酶的酶活中心氨基酸组成:发现PMSF(苯甲基磺酰氟)、2,3-丁二酮、NAI(N-乙酰基咪唑)、IAA(碘代乙酸)、DTT(二硫苏糖醇)修饰对菊粉酶活力影响不大,说明丝氨酸、精氨酸、酪氨酸以及赖氨酸均不是酶催化反应所必需氨基酸,且酶活中心不存在二硫键;DEPC(焦碳酸二乙酯)和EDCI(碳二亚胺盐酸盐)修饰菊粉酶的结果表明:菊粉酶的催化活性中心存在一个组氨酸残基和一个谷氨酸(天冬氨酸)残基,且组氨酸残基参与了菊粉酶的底物结合过程,而谷氨酸(天冬氨酸)残基只参与催化水解过程,推测Bacillus smithii T7产耐热菊粉酶的催化机理是经典酸碱催化机制;利用NBS(N-溴代琥珀酰亚胺)修饰菊粉酶及Tsou’s plot分析,发现菊粉酶中有两个色氨酸残基为酶活性必需基团,而且色氨酸修饰前后,菊粉酶耐热性的变化表明色氨酸构成的疏水环境可能对Bacillus smithii T7产菊粉酶的耐热性起重要作用。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-10
引言  10-11
1 文献综述  11-22
  1.1 菊粉  11-13
    1.1.1 菊粉的结构特征  11-12
    1.1.2 菊粉的性质  12
    1.1.3 菊粉的营养与生理功能  12-13
  1.2 菊粉酶  13-16
    1.2.1 菊粉酶的分类  13
    1.2.2 菊粉酶的性质  13
    1.2.3 菊粉酶的来源  13
    1.2.4 菊粉酶的应用  13-14
    1.2.5 菊粉酶纯化及酶性质研究现状  14-16
  1.3 蛋白质分离纯化方法  16
    1.3.1 凝胶过滤层析  16
    1.3.2 离子交换层析  16
  1.4 蛋白质的化学修饰  16-18
    1.4.1 概念  16
    1.4.2 蛋白质分子主链结构的修饰  16-17
    1.4.3 蛋白质分子侧链基团化学修饰  17
    1.4.4 侧链基团的修饰反应  17-18
  1.5 化学修饰程度和部位的测定  18-20
    1.5.1 光谱分析方法  18-19
    1.5.2 动力学定量处理  19-20
  1.6 立题背景及意义  20-21
  1.7 本课题研究内容  21-22
2 Bacillus smithii所产菊粉酶的分离纯化  22-38
  2.1 引言  22
  2.2 材料与方法  22-28
    2.2.1 实验材料与试剂  22-23
    2.2.2 实验仪器  23
    2.2.3 主要实验方法  23-28
  2.3 结果与讨论  28-36
    2.3.1 Bacillus smithii T4产菊粉酶的分离纯化  28-33
    2.3.2 Bacillus smithii T7产菊粉酶的分离纯化  33-36
  2.4 本章小结  36-38
3 Bacillus smithii产菊粉酶的酶学性质分析  38-46
  3.1 引言  38
  3.2 实验材料与方法  38-39
    3.2.1 实验材料与试剂  38
    3.2.2 实验仪器  38
    3.2.3 主要实验方法  38-39
  3.3 结果与讨论  39-44
    3.3.1 温度对酶活大小的影响  39-41
    3.3.2 pH对菊粉酶酶活的影响  41-42
    3.3.3 菊粉酶动力学常数的测定  42-44
    3.3.4 Bacillus smithii T7与Bacillus smithii T4产菊粉酶酶学性质比较  44
  3.4 本章小结  44-46
4 Bacillus smithii T7产菊粉酶的化学修饰研究  46-70
  4.1 引言  46
  4.2 材料与方法  46-51
    4.2.1 实验材料与试剂  46-47
    4.2.2 实验仪器  47
    4.2.3 主要实验方法  47-51
  4.3 结果与讨论  51-69
    4.3.1 NBS对菊粉酶化学修饰结果分析  51-59
    4.3.2 DEPC对菊粉酶化学修饰结果分析  59-62
    4.3.3 EDCI对菊粉酶化学修饰结果分析  62-64
    4.3.4 DTNB对菊粉酶活力的影响  64
    4.3.5 PCMB对菊粉酶活力的影响  64-66
    4.3.6 DTT对菊粉酶活力的影响  66
    4.3.7 NAI对菊粉酶活力的影响  66-67
    4.3.8 IAA对菊粉酶活力的影响  67
    4.3.9 2,3-丁二酮对菊粉酶活力的影响  67-69
  4.4 本章小结  69-70
结论  70-71
参考文献  71-74
攻读硕士学位期间发表学术论文情况  74-75
致谢  75-76

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 酶制剂（酵素）
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