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人类心脏发育相关的三个候选基因的克隆和功能研究

作　者: 赵玉莲
导　师: 吴秀山；袁婺洲
学　校: 湖南师范大学
专　业: 发育生物学
关键词: 心脏发育候选基因锌指蛋白 MAPK信号途径
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

目前，心血管系统疾病已经成为严重威肋、人类的健康的疾病之一。为攻克这一顽症，首先必须从机制上阐明其发病原因。在心血管系统疾病的研究中已发现，某些基因在时空上的表达紊乱可导致先天性心脏病，而对部分心血管系统病症高发人群的研究也证明部分后天形成的心脏病与遗传因素有关。我们研究室进行的大规模筛选和克隆人类心脏发育的相关基因工作为理解心脏发育的分子机理、探索心脏疾病发病的分子机制提供充实的理论基础。为了确定人类心脏发育的候选基因和心脏疾病相关基因，我们从人类心脏cDNA文库中克隆了两个人类锌指蛋白新基因，ZNF325和ANKZF1b以及一个PDZ结构域蛋白基因AHNAKc。ZNF325和ANKZF1b分别位于位于染色体7p22和2q36.1，属于Cys2／His2型锌指蛋白家族。Nortbern杂交结果表明ZNF325在人类胚胎各时期和成人各组织中都有广泛的表达而在心脏中的表达有增强的趋势。RT-PCR实验表明ANKZF1b在人类胚胎组织在心、脑、胃和肾特异性表达。这表明ZNF325和ANKZF1b对心脏发育可能有着重要的作用。通过分别构建到具有增强型绿色荧光蛋白的真核表达载体，转染COS-7细胞系，瞬时表达后荧光显微镜观察，发现ZNF325、ANKZF1b的编码蛋白主要定位在细胞核。ZNF325和ANKZF1b分别在COS-7细胞中过量表达时都抑制AP-1和SRE的转录活性。ZNF325转录活性的拆片分析和RNAi分析进一步证明C2H2锌指区域对报告基因AP-1和SRE起着重要的抑制作用。这些表明ZNF325和ANKZF1b可能在MAPK信号途径有着重要的作用。AHNAKc基因位于染色体11q12.2，AHNAKc通过构建到与绿色荧光蛋白融合的真核表达载体pEGFP上，显微镜观察发现AHNAKc表达的蛋白定位在细胞质和核膜上。AHNAKc含有PDZ的结构域，PDZ是一个在蛋白质相互作用中起着重要作用的基元，可能在细胞的信号途径中有着重要作用。AHNAKa在心脏肌肉收缩中有着重要作用，因而研究它对心脏发育的影响是十分必要的。综合这些结果，我们可以初步得出结论，ZNF325、ANKZF1b和AHNAKc可能是心脏疾病发生的候选基因，可能在细胞的信号途径中起着重要的调控作用。

全文目录

中文摘要  3-5
英文摘要  5-11
第一章引言和文献综述  11-31
  1.1 心脏发育的基因调控机理  11-19
    1.1.1 果蝇心脏发育的基因调控  12-14
    1.1.2 脊椎动物心脏发育的基因调控  14-19
  1.2 锌指蛋白转录因子在心脏发育基因调控中的作用  19-25
    1.2.1 锌指蛋白基因家族  19-21
    1.2.2 锌指的结构  21-22
    1.2.3 锌指蛋白基因在心脏发育过程中的作用  22-25
  1.3 MAPK信号途径与心脏发育  25-28
  1.4 本研究的意义与展望  28-31
第二章实验材料和方法  31-45
  2.1 主要材料  31-35
    2.1.1 主要的基因工程酶和试剂盒  31-32
    2.1.2 菌株和质粒  32
    2.1.3 主要生化试剂  32
    2.1.4 缓冲液和培养基  32-33
    2.1.5 其他试剂和原料  33
    2.1.6 生物信息学软件和数据库  33-34
    2.1.7 主要实验仪器  34-35
  2.2 实验方法  35-45
    2.2.1 总RNA提取  35
    2.2.2 人类胚胎心脏cDNA文库的构建  35-36
    2.2.3 巢式PCR(nest PCR)扩增开放阅读框  36-37
    2.2.4 凝胶回收  37
    2.2.5 连接  37
    2.2.6 感受态细胞的制备  37-38
    2.2.7 连接产物的转化  38
    2.2.8 重组克隆的筛选和鉴定  38
    2.2.9 质粒酶切  38-39
    2.2.10 Northern杂交实验  39
    2.2.11 反转录RT-PCR  39-40
    2.2.12 常规细胞培养及转染  40-41
    2.2.13 亚细胞定位观察  41
    2.2.14 基因信号途径的report assay  41-42
    2.2.14 RNAi实验  42-43
    2.2.15 酵母双杂交  43-45
第三章锌指蛋白基因ZNF325的克隆和功能研究结果  45-59
  3.1 ZNF325基因概况  45
  3.2 序列分析  45-47
  3.3 ZNF325蛋白与RBAK蛋白的比较  47-48
  3.4 ZNF325基因的人类组织Northern杂交结果  48-50
  3.5 ZNF325蛋白的亚细胞定位分析  50-52
    3.5.1 EGFP-N1-ZNF325重纰质粒的构建  50-52
    3.5.2 细胞培养及转染  52
  3.6 通过报告基因检测 ZNF325的转录活性  52-59
    3.6.1 质粒构建  52-54
    3.6.2 表达报告基因检测结果  54-55
    3.6.3 ZNF325结构域片段拆除研究  55-56
    3.6.4 RNAi对ZNF325的转录活性的影响  56-59
第四章 ANKZF1b基因的克隆和功能研究结果  59-65
  4.1 锌指新基因ANKZF1b的克降和序列分析结果  59-61
  4.2 ANKZF1b在人体早期胚胎中的的表达  61-62
  4.3 ANKZF1b基因的亚细胞定位分析  62-63
  4.4 ANKZF1b在MAPK信号途径中抑制AP-1和SRE的转录活性  63-64
  4.5 ANKZF1b基因的实验结果总结与讨论  64-65
第五章 AHNAKc基因的克隆和功能研究结果  65-73
  5.1 AHNAKc克隆和序列分析  65-68
  5.2 AHNAKc与AHNAKa的剪切方式比较  68-70
  5.3 AHNAKc蛋白的亚细胞定位  70-71
  5.4 酵母双杂交  71-72
    5.4.1 pGBKT7-AHNAKc重组质粒的构建  71
    5.4.2 酵母双杂交  71-72
  5.5 AHNAKc基因实验结果的讨论  72-73
结语  73-75
参考文献  75-84
致谢  84-85
附录  85-89
  附录1 英文缩写词简表  85-87
  附录2 攻读学位期间发表的学术论文和综述  87-89

人类心脏发育相关的三个候选基因的克隆和功能研究

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