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NIRF蛋白在细胞外对HBV核心蛋白泛素化作用探讨

作　者: 杨艳
导　师: 段昌柱
学　校: 重庆医科大学
专　业: 细胞生物学
关键词: NIRF HBc 体外相互作用 GST-pull down 泛素化
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的: NIRF蛋白是泛素化E3连接酶,通过构建各个表达质粒,包括真核表达质粒pFLAG-NIRF,原核表达质粒pGST-NIRF、pGST-HBc,并在HEK293细胞或E.coil BL21(DE3)中表达,纯化出GST-NIRF、GST-HBc蛋白;通过GST pull down证明NIRF与HBc在细胞外存在蛋白-蛋白相互作用;建立泛素化体系,探讨HB(cHBV core protein)能否被NIRF蛋白泛素化。方法:(1)根据NIRF基因序列设计引物,NIRF基因经PCR扩增后连接到pMD19T上,经酶切连接后构建pGST-NIRF原核表达质粒;pGST-NIRF转化E.coil BL21(DE3),优化表达条件使GST-NIRF蛋白在上清中大量完整表达,并探索一条高纯度蛋白纯化方法用以获得GST-NIRF蛋白;用脂质体转染法将pCDNA3-HBc转染至HEK293细胞,检测其表达;纯化后的GST-NIRF蛋白与转染pCDNA3-HBc的细胞上清共同孵育,经GST pull down证明2者之间是否存在相互结合。(2)根据HBc基因序列设计引物,HBc基因经PCR扩增后连接到T载体pTArget上,经酶切连接后构建pGST-HBc原核表达质粒;pGST-HBc转化E.coil BL2(1DE3)经优化表达条件后纯化出GST-HBc蛋白;设计NIRF基因引物,基因经扩增后插入到p3*FLAG-CMV-10中构建pFLAG-NIRF质粒;脂质体转染法将pFLAG-NIRF转染至HEK293细胞,检测其表达;纯化后GST-HBc蛋白与转染pFLAG-NIRF的细胞上清共同孵育,经GST pull down证明2者之间是否存在相互结合。(3)纯化后的GST-NIRF、GST-HBc蛋白用以构建细胞外泛素化体系,分别作为泛素化E3连接酶及泛素化底物。泛素化反应完成后,产物通过SDS-PAGE分离,蛋白免疫印迹检测是否有泛素化条带产生,从而确定NIRF是否能泛素化HBc。结果:(1)成功构建pGST-NIRF原核表达质粒并在E.coil BL21(DE3)顺利表达,优化表达条件得到GST-NIRF在细胞上清中的大量完整表达,探索出一条GST-NIRF蛋白的纯化方式获得较高纯度的GST-NIRF全长蛋白,为蛋白相互作用鉴定及泛素化反应奠定基础;通过GST pull down证明NIRF与HBc能够在细胞外相互结合。(2)成功构建pGST-HBc原核表达质粒并在E.coil BL21(DE3)顺利表达,优化表达条件得到GST-HBc较高浓度表达,纯化出高浓度的GST-HBc蛋白;成功构建pFLAG-NIRF真核表达质粒,并在HED293细胞中顺利表达;通过GST pull down证明HBc与NIRF能够在细胞外相互结合。(3)体外泛素化结果提示,HBc可能被NIRF泛素化。HBc抗体检测效果不理想,无法准确判定还需进一步实验证明。结论: GST pull down证明NIRF蛋白及HBc能够在细胞外相互结合;泛素化结果表明,NIRF蛋白有可能泛素化HBc蛋白,证据不充足还有待进一步完善,另此结果只能为NIRF对HBc的泛素化作用提供体外证据。

全文目录


英汉缩略语名词对照  6-8
摘要  8-11
ABSTRACT  11-14
前言  14-16
第一章 GST-NIRF pulls down HBV 核心蛋白  16-34
  第一节 pGST-NIRF 原核表达质粒的构建及表达  16-27
    1 材料与方法  16-22
    2 实验结果  22-26
    3 讨论  26-27
    4 小结  27
  第二节 GST-NIRF 蛋白纯化  27-30
    1 材料与方法  27-28
    2 结果  28-29
    3 讨论  29-30
    4 小结  30
  第三节 GST-NIRF pulls down HBV 核心蛋白  30-32
    1 材料与方法  30-31
    2 结果  31-32
    3 讨论  32
    4 小结  32
  参考文献  32-34
第二章 GST-HBc pulls down NIRF  34-52
  第一节 pGST-HBc 原核表达质粒的构建及表达  34-39
    1 材料与方法  34-36
    2 结果  36-39
    3 讨论  39
    4 小结  39
  第二节 GST-HBc 表达条件优化及纯化  39-44
    1. 材料与方法  39-40
    2. 结果  40-44
    3 讨论  44
    4 小结  44
  第三节 pFLAG-NIRF 真核表达质粒的构建及表达  44-49
    1 实验材料与方法  44-47
    2 结果  47-49
    3 讨论  49
    4 小结  49
  第四节 GST-HBc pulls down NIRF protein  49-51
    1 实验材料与方法  49
    2 结果  49-50
    3 讨论  50-51
    4 小结  51
  参考文献  51-52
第三章 GST-NIRF 对HBV core protein 的细胞外泛素化作用探讨  52-60
  第一节 GST-NIRF 蛋白及GST-HBc 蛋白的纯化  52-53
    1 实验材料与方法  52
    2 结果  52-53
    3 小结  53
  第二节 泛素化体系的建立  53-59
    1 实验材料与方法  53-56
    2 结果  56
    3 讨论  56-58
    4 结论  58-59
  参考文献  59-60
全文总结  60-61
文献综述  61-66
   参考文献  64-66
致谢  66-67
攻读硕士研究生期间发表的文章  67

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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