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壬基酚和双酚A对斑马鱼（Danio rerio）精巢发育组织学及性激素合成酶基因表达影响的研究

作　者: 刘晓丽
导　师: 周忠良
学　校: 华东师范大学
专　业: 动物学
关键词: 壬基酚 双酚A 斑马鱼(Danio rerio) 精巢 FSHR CYP17 CYP11B CYP19A
分类号: X174
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


环境内分泌干扰物指进入生物体内,可干扰体内内分泌物质的合成、释放、运输、代谢等过程,激活或抑制内分泌系统的功能,破坏机体内环境的稳定,可导致生殖障碍、出生缺陷、发育异常、代谢紊乱以及某些癌症的发生。壬基酚(NP)和双酚A(BPA)是广泛存在水体中的环境内分泌干扰物,影响鱼类的生殖和发育。已经有报道称内分泌干扰物对动物的精巢结构产生了影响,如能使精子质量降低、精液量减少精子凝聚、出现卵母细胞、精巢纤维化退化等。但是对NP和BPA调节精巢发育的分子机制以及精巢结构与分子机制相结合的研究不多。自然条件下,鱼类精巢的发育受到体内性激素的调控,11-酮基睾酮(11-KT)和17p雌二醇(E2)精巢合成的主要性激素。与其他脊椎动物相同,鱼类性腺激素的合成和转化受细胞色素P450酶系的催化调节。P45011p羟化酶(CYP11B)、P450芳香化酶(CYP19A)是11-KT和E2合成的关键酶,因此,定量研究NP和BPA对性腺细胞色素P450酶系表达影响,是揭示环境内分泌干扰物对鱼类性腺发育影响机制的重要途径。本文通过研究性激素合成酶基因表达的情况,研究了环境内分泌干扰物NP和BPA对精子发育和精巢结构影响的作用途径,以期为生物标志物筛选和环境评价提供必要的生态毒理学数据。然而野外水环境是比较复杂的,而且环境污染物种类繁多,不可能仅存在某一种内分泌干扰物单独作用,因此本文也研究了NP和BPA的联合效应。在本文的研究中,我们用NP、BPA和NP+BPA对斑马鱼进行暴露,将成年雄性斑马鱼(Danio rerio)暴露于不同浓度NP(0、125、250、500μg·L-1)、BPA(0、500、1000、2000、400μg·L-1)和NP62.5μg·LL+BPA(0、500、1000、2000μg·L-1)21d,用常规组织学方法研究试验鱼精巢组织结构的变化,用荧光定量PCR (QRT-PCR)方法检测试验鱼精巢性激素合成酶(CYP17、CYP11B和CYP19A)以及雌、雄激素受体(ERα、AR)和促卵泡激素受体(FSHR)基因的表达,同时也测试了肝脏中卵黄蛋白原(VTG) mRNA和ERα的表达。研究结果显示：暴露NP和BPA的斑马鱼精巢结构都有变化,随着浓度的增加精小管中精液量减少,成熟的精子凝集,非细胞区域增加；BPA浓度为1000μg·L-1时出现了卵细胞,NP和BPA最高浓度组精巢组织都有退化现象。随着NP和BPA浓度的增加诱导了肝脏中VTG和ERa mRNA的表达,出现了典型的雌激素效应。同时促进了精巢中CYP19A mRNA的表达,所以鱼类精巢除了VTG能作为环境雌激素的生物标志物外,CYP19A以及ERa基因表达变化可作为环境雌激素影响的早期预警。NP和BPA对CYP17 mRNA表达显著下调具有负相关的剂量效应关系,但是当这两种物质联合暴露时,却促进了CYP17 mRNA的表达。NP抑制了CYP11B mRNA的表达,BPA和NP+BPA却促进了CYP11B的表达。由此看来NP和BPA的作用机制不完全相同。NP和BPA对精巢AR mRNA的表达无明显影响。BPA4000μg·L-1时毒性效应很明显,跟低浓度组相比性激素合成酶的表达有下调的趋势。BPA以及NP+BPA联合暴露组都上调了FSHR mRNA的表达。(NP62.5+BPA500)μg·L-1时显示拮抗作用,(NP62.5+BPA1000)μg·L-1时显示协同效应,并且基本上为差异最显著组。结论：(1)NP和BPA对精巢产生了影响,随着浓度的增加精小管中精液量减少,成熟的精子凝集,非细胞区域增加,出现卵细胞。NP和BPA诱导VTG和ERαmRNA的表达具有雌激素效应。(2)NP和BPA通过抑制CYP17表达,可能抑制睾酮(T)的合成,通过诱导CYP19A的表达,激活了内源雌激素的活性,促进了内源雌激素的合成。(3)NP下调了CYP11B的表达,BPA对CYP11B的表达没太大影响,并且它们对AR都没影响。说明NP抑制了雄激素的合成,但没干扰雄激素的作用。BPA对雄激素的合成没有产生影响。(4)NP和BPA的作用机制,不完全相同,但是它们都破坏了原有的性激素平衡。(5)NP和BPA联合作用时既存在协同作用又存在拮抗作用,NP扰乱了BPA的作用机制,联合作用机制复杂。

全文目录


摘要  6-8
ABSTRACT  8-12
第一章 内分泌干扰物对鱼类精巢发育影响的研究进展  12-24
  第一节 鱼类精子发生调节机制  12-19
  第二节 内分泌干扰物对精巢结构影响的研究进展  19-21
  第三节 NP和BPA对精巢结构影响  21-22
  第四节 本文研究内容  22-24
第二章 斑马鱼性激素合成酶及性激素受体基因表达定量检测方法的建立  24-32
  第一节 前言  24
  第二节 材料与方法  24-27
  第三节 结果  27-32
第三章 NP和BPA对斑马鱼精巢组织的影响  32-38
  第一节 前言  32
  第二节 材料与方法  32
  第三节 结果  32-36
  第四节 讨论  36-38
第四章 NP和BPA对斑马鱼的雌激素效应  38-41
  第一节 前言  38
  第二节 材料与方法  38
  第三节 结果  38-40
  第四节 讨论  40-41
第五章 NP和BPA对性激素合成酶及性激素受体基因表达的影响  41-51
  第一节 前言  41
  第二节 材料与方法  41
  第三节 结果  41-47
  第四节 讨论  47-51
参考文献  51-62
附录  62-65
  附录1 总RNA的抽提  62
  附录2 逆转录(RT)反应体系  62-63
  附录3 Real-time PCR反应体系  63
  附录4 常用溶液的配方  63-64
  附录5 待发表论文  64-65
致谢  65

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中图分类: > 环境科学、安全科学 > 环境科学基础理论 > 环境生物学 > 环境动物学
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