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丙戊酸钠对人外周血淋巴细胞功能的影响及人白细胞介素7重组蛋白原核表达载体在大肠杆菌中的表达和鉴定

作　者: 耿梅
导　师: 何贤辉
学　校: 暨南大学
专　业: 免疫学
关键词: 丙戊酸 淋巴细胞 组蛋白去乙酰化酶抑制剂 全血培养 胞内细胞因子染色 IL-7 包涵体表达 原核表达载体 免疫印迹
分类号: R378
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的：研究丙戊酸(VPA)对人外周血淋巴细胞的活化、凋亡、及细胞因子表达的影响；构建重组人白细胞介素7(rhIL-7)的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并鉴定。方法：1.双色荧光抗体染色结合流式细胞术分析VPA对多克隆刺激剂二丁酸佛波酯(phorbol 12,13-dibutyrate, PDB)和离子霉素(ionomycin, Ion)刺激下的人外周血T细胞CD69表达的影响；DiOC6(3)染色检测VPA对淋巴细胞凋亡的影响；利用细胞内细胞因子染色检测VPA对T细胞IL-2、IL-4、IFN-y、TNF-α表达的影响,以探讨其保护机制。2.以RT-PCR方法扩增编码人IL-7的cDNA片段,插入至pET-3d载体中,构建rhIL-7的原核表达载体,阳性克隆经测序鉴定,转化至大肠杆菌BL21(DE3),优化rhIL-7表达条件,利用免疫印迹鉴定重组蛋白。结果：1. VPA对PDB和Ion诱导的人外周血T细胞CD69表达具有明显的促进作用(P<0.01)；同时低浓度的VPA(1、5mmol/L)可以抑制T细胞活化诱导的凋亡,高浓度作用相反；胞内细胞因子染色分析显示,VPA在低浓度时能明显促进IL-2表达,高浓度时则起抑制作用；同时VPA能显著促进IFN-γ、TNF-α的分泌(P<0.05),并呈剂量依赖性,而对IL-4表达影响较小。2.人IL-7重组载体经DNA测序显示包含正确的rhIL-7编码序列,重组载体转入大肠杆菌后,经IPTG诱导后外源蛋白表达,相对分子质量为17400,与IL-7理论分子质量一致；免疫印迹显示,外源蛋白可以被人IL-7特异性抗体识别,表明原核表达的外源蛋白是rhIL-7。rhIL-7主要表达于包涵体中,包涵体表达优化条件为：温度为37℃、IPTG浓度为0.4 mmol/L、诱导时间为4h。结论：1.研究表明VPA在低浓度时可以明显的促进外周血T细胞的体外活化、IL-2表达和抑制其发生凋亡,高浓度作用相反；同时VPA可以显著的促进炎症细胞因子IFN-γ、TNF-α表达,具有明显的剂量依赖性。2.在成功克隆人IL-7基因cDNA的基础上,构建了rhIL-7的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得大量表达。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-11
第一章 丙戊酸对人外周血淋巴细胞的影响  11-31
  一.引言  11-15
    1 表观遗传学  11-12
    2 VPA药理作用  12-14
      2.1 抗肿瘤作用  12-13
      2.2 免疫调节活性  13-14
    3 本课题的研究目的和意义  14-15
  二.实验材料与设备  15-17
    1 实验材料  15
    2 主要仪器和设备  15
    3 主要试剂  15-16
    4 本实验中所用主要试剂配制方法见附录Ⅰ  16-17
  三.实验方法与步骤  17-19
    1 全血培养  17
    2 外周血T淋巴细胞体外活化  17
    3 DiOC_6(3)染色检测线粒体膜电势  17
    4 细胞内因子染色  17-18
    5 流式细胞仪分析  18
    6 统计学分析  18-19
  四.实验结果  19-23
    1 VPA可促进人外周血T细胞CD69的表达  19
    2 VPA对线粒体膜电势的影响  19-20
    3 VPA对细胞因子表达的影响  20-23
  五.讨论  23-26
  六.结论  26-27
  REFERENCES(参考文献)  27-31
第二章 人白细胞介素7原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达鉴定  31-54
  一.引言  31-36
    1 IL-7的研究进展  31-34
    2 包涵体复性  34-35
    3 本课题的研究目的和意义  35-36
  二.实验材料与设备  36-38
    1 主要仪器和设备  36
    2 主要试剂和材料  36-37
    3 本实验中所用主要试剂配制方法见附录Ⅰ  37-38
  三.实验方法与步骤  38-41
    1 人类IL-7基因原核表达载体的构建和序列分析  38-39
      1.1 人类IL-7基因扩增的引物设计  38
      1.2 PCR扩增人类IL-7 cDNA  38-39
    2 人类IL-7原核表达载体在E coli中的表达  39-41
      2.1 rhIL-7蛋白的诱导表达  39
      2.2 诱导剂浓度的选择  39
      2.3 诱导时间的选择  39
      2.4 样品处理与SDS-PAGE电泳  39
      2.5 免疫印迹分析  39-41
  四.实验结果  41-47
    1 人IL-7 cDNA编码区片段的克隆和原核表达载体构建  41-44
    2 IL-7重组蛋白在E.coli的表达与条件优化  44-47
      2.1 pET-3d/IL-7原核表达载体在E.coli中的表达与鉴定  44-45
      2.2 IPTG对Il-7重组蛋白表达的影响  45-46
      2.3 诱导时间对IL-7重组蛋白表达的影响  46-47
  五.讨论  47-49
  六.结论  49-50
  REFERENCES(参考文献)  50-54
附录Ⅰ 本实验中所用主要试剂配制方法  54-56
附录Ⅱ 英文缩略词  56-57
附录Ⅲ 在校期间发表及参与研究论文情况  57-58
致谢  58

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学） > 病原细菌
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