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单细胞全基因组技术的建立和评价

作　者: 杨祎
导　师: 邵志峰；郭妍
学　校: 上海交通大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 单细胞分选激光显微切割全基因组扩增
分类号: Q75
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

单细胞是多细胞生物的基本单元,多细胞生物的发育从单细胞开始,在严格的时间和空间序列中不断分裂,但是这样的复杂过程只能在单细胞水平才能真正理解。另外,多细胞生物体内每个细胞都处于独特的微环境中,没有两个完全一样的细胞,特别是肿瘤组织中,高度异质性的存在使得从单细胞的角度进行研究成为必须。结合单细胞分选技术,通过全基因组扩增技术和高通量分析技术,单细胞的全基因组分析已经成为可能,并已有一些应用的实例。目前,单细胞分选技术大多局限于对悬浮细胞的分选。应用于实体瘤研究领域则需要将实体瘤组织消化成细胞悬液,这样一来,分选的细胞就丢失了所在的空间信息,因此,该法对于特定空间位置的细胞分选就无能为力了。本文所建立的方法不仅对能对单个悬浮细胞进行分选,更重要的是建立了一种组织切片中完整单个细胞核的激光显微切割分选方法。该方法的建立为空间位置特异的细胞分选,例如转移的少量癌细胞的分选提供了方法,并将大大减低测序的费用。单细胞的基因组信息非常少,人的单个细胞基因组DNA量只有6pg,对这么微量的基因组DNA进行测序,首先必须进行全基因组放大。本文采用了GenomePlex Library的单细胞全基因组放大方法,并对该法的扩增效率、重复性、保真性与扩增线性进行了研究,研究结果说明所得到的全基因组放大产物适用于下游的高通量研究。本文所建立的单细胞分选和全基因组放大方法,将能用于单细胞的全基因组研究,特别是基于组织样品原位分选单个细胞的全基因组分析。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-12
第一章引言  12-18
  1.1 单细胞研究的意义  13-15
  1.2 目前已有的单细胞分选技术及相应的优势与缺陷  15-16
  1.3 目前已有的全基因组扩增技术及相应的优势与缺陷  16-17
  1.4 本章小节  17-18
第二章材料与方法  18-27
  2.1 材料  18-19
    2.1.1 主要仪器  18
    2.1.2 主要试剂  18-19
  2.2 主要实验方法  19-26
    2.2.1 HT1080 细胞培养  19
    2.2.2 DNA 提取  19
    2.2.3 组织冰冻切片  19-20
    2.2.4 冰冻切片的苏木精染色  20
    2.2.5 HT1080 细胞涂片的制备及cresyl violet 染色  20
    2.2.6 LCM 分选单个完整细胞核  20-22
    2.2.7 分选细胞的全基因组扩增(WGA)  22
    2.2.8 全基因组扩增产物随机克隆测序验证  22-23
    2.2.9 利用胃癌相关 SNP 位点检验全基因组扩增的保真性  23-24
    2.2.10 全基因组扩增线性的验证  24-26
  2.3 本章小节  26-27
第三章实验结果  27-39
  3.1 单个或少量细胞分选及全基因组扩增  27-32
    3.1.1 冰冻切片中单个完整细胞核的确定  27
    3.1.2 单个完整细胞核分选时切片厚度的确定  27-28
    3.1.3 通过激光显微切割分选完整单个细胞核  28-30
    3.1.4 通过GenomePlex library 技术进行单细胞全基因组扩增  30-31
    3.1.5 临床胃癌组织的冰冻切片、苏木精染色及少量细胞分选  31-32
    3.1.6 少量胃癌细胞全基因组放大  32
  3.2 全基因组扩增产物的验证  32-38
    3.2.1 全基因组扩增效率及重复性  32
    3.2.2 全基因组克隆产物随机克隆验证  32-34
    3.2.3 利用PCR-RFLP方法进行PSCA基因单核苷酸多态性的基因型分析  34-35
    3.2.4 利用直接测序方法进行PSCA基因多态性的基因型分析  35-36
    3.2.5 全基因组扩增线性的验证  36-38
  3.3 本章小节  38-39
第四章总结与展望  39-40
参考文献  40-45
致谢  45-46
攻读硕士学位期间已发表或录用的论文  46

单细胞全基因组技术的建立和评价

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