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补血草盐腺细胞特异性cDNA文库构建

作　者: 王晓玲
导　师: 曹子谊
学　校: 山东师范大学
专　业: 发育生物学
关键词: 中华补血草盐腺 cDNA文库激光显微切割
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 57次
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内容摘要

土壤中过多的可溶性盐分对植物的不利影响是多种多样的,全世界约有20%的土地盐渍化,还有近50%的灌溉土地受次生盐渍化的影响。盐渍化对可耕地的破坏影响和制约着社会经济的发展。因而,研究植物的耐盐机理显得尤为重要。根据盐生植物的抗盐生理机制及其形态结构和生态学特征的不同,Breckle(1990)将盐生植物概括为三类:真盐生植物、假盐生植物和泌盐盐生植物。泌盐盐生植物种类繁多,在我国分布也极其广泛,海滨、盐沼、盐湖周边、沙漠、草甸和灌丛等地都有泌盐盐生植物分布。植物泌盐是一个主动的生理过程,泌盐盐生植物主要通过叶片或茎上的盐腺(salt gland)或盐囊泡(salt bladder)将过多的盐分排出体外,以此逃避盐胁迫。中华补血草(Limonium sinense Kuntze)为白花丹科补血草属(Limonium)多年生泌盐草本植物,它具有特殊的泌盐结构-盐腺,可将吸收到体内的盐离子排到体外,从而避免盐分胁迫的伤害。本研究主要利用显微切割技术(Laser Microdissection,LMD),从撕取的中华补血草的下表皮上切取盐腺细胞,从中提取出盐腺细胞中的总RNA,并反转录体外扩增出aRNA,以用于构建补血草盐腺细胞特异性cDNA文库。在研究过程中发现:(1)用Carnoy’s固定液固定材料,既能脱色又能很好地保存RNA,甚至从固定3个月的样品中仍能提取出较多的RNA。(2)五月至十月,中华补血草的叶片变得肉质化,变脆,难以撕取下表皮,取材具有阶段性。(3)用含异硫氰酸胍的裂解液裂解补血草下表皮细胞,从中提取的总RNA量很少,甚至于电泳检测不到条带,而用改良的CTAB法提取效果较好。(4)实验过程中,从300mM NaCl处理的材料中提取出的RNA在量上要比非盐处理材料的多,尽管不能确定所得到RNA的量的差异是否是因为盐处理造成的,但是在取材前用300mM NaCl处理补血草植株应该是有利无害。由于时间和材料的限制,本研究仅对补血草盐腺细胞特异性cDNA文库的构建进行了初步的探讨,没有完成最后的cDNA文库的构建工作。其次,本研究通过扫描电镜技术(Scanning Electron Microscopes, SEM)研究了中华补血草盐腺的发育,结果发现:(1)经过盐处理的中华补血草叶中盐腺的数目比未经盐处理的多,但是在发育开始的时间上没有明显差别。(2)在同一片幼叶中可同时存在发育成熟的和发育中的盐腺细胞,即同一片叶上可存在不同发育阶段的盐腺细胞。(3)中华补血草盐腺细胞的发育时间要远比气孔的发育时间早。另外,本实验还结合一种新的Na~+特异性的指示剂CoroNa Green研究了哇巴因(ouabain,一种动物Na~+/K~+-ATPase的抑制剂)对中华补血草的生长情况及其根尖中钠的含量和分布的影响。实验发现盐(200mM NaCl)和抑制剂(100μM ouabain)共同处理条件下,根尖中钠特异性的荧光明显增强,显示Na~+含量显著升高。因而得出结论:在哇巴因处理下,植物体内发生Na~+的积聚,从而推测补血草中存在某种对ouabain敏感的Na~+转运体,且它对中华补血草在盐胁迫条件下的正常生长起着重要的作用。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-10
第一部分文献综述  10-24
  1. 植物对盐胁迫的适应  10-16
    1.1 植物的耐盐机理  10-12
    1.2 泌盐结构  12-14
    1.3 泌盐机理  14-15
    1.4 泌盐盐生植物的开发利用  15-16
  2. 激光显微切割（Laser Microdissection，LMD）技术  16-20
    2.1 LMD 的工作原理  16-18
    2.2 LMD 的影响因素  18-19
    2.3 LMD 的应用  19
    2.4 LMD 技术展望  19-20
  3. RNA 的体外扩增原理  20-21
  4. 石蜡切片技术  21
  5. 哇巴因（ouabain）  21
  6.CoroNa Green  21-24
第二部分实验论文  24-40
  一、实验材料及实验方法  24-31
    1. 实验材料  24-25
      1.1 植物材料  24
      1.2 培养基  24
      1.3 主要仪器设备  24
      1.4 酶及化学试剂  24-25
      1.5 Carnoy's 固定液  25
      1.6 改良的CTAB 提取液  25
    2. 实验方法  25-31
      2.1 盐腺细胞的制备  25-26
      2.2 几种植物总RNA 的提取方法  26-28
      2.3 RNA 体外扩增  28-29
      2.4 补血草盐腺的扫描电镜及石蜡切片观察  29-30
      2.5 抑制剂处理及CoroNa Green 染色  30-31
  二、实验结果与分析  31-38
    1. 不同灭菌处理对中华补血草种子萌发的影响  31
    2. 不同固定液处理下表皮对后续步骤的影响  31-33
      2.1 对盐腺切割的影响  31-32
      2.2 对提取的RNA 的数量和质量的影响  32-33
    3. 激光显微切割技术获取盐腺  33-34
    4. 中华补血草RNA 的提取和体外扩增  34-36
    5. 补血草盐腺发育的扫描电镜观察结果  36
    6. 中华补血草幼苗哇巴因处理及根尖CoroNa Green 染色结果  36-38
  三、讨论  38-40
参考文献  40-44
攻读硕士学位期间整理发表的论文  44-45
致谢  45

补血草盐腺细胞特异性cDNA文库构建

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