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肝细胞癌病人外周血中循环肿瘤细胞的检测和临床意义
作 者: 刘道永
导 师: 钦伦秀
学 校: 复旦大学
专 业: 外科学
关键词: 肝细胞 癌 循环肿瘤细胞 滤过富集 手术 比较基因组杂交 全基因组扩增 单细胞 激光捕获显微切割 肝细胞癌
分类号: R735.7
类 型: 博士论文
年 份: 2007年
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引 用: 2次
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内容摘要
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原发性肝癌(主要是肝细胞癌，hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一，位居全球恶性肿瘤发病率的第5位，发病率仍持续升高。目前已成为我国第二位癌症死亡原因。尽管近几十年以来在肝癌诊治和基础研究方面均取得了长足的进步，但总体而言，肝癌的预后并没有得到显著的改善，5年生存率仅为5％左右。手术切除仍是最主要的治疗方法，转移复发已成为阻碍HCC病人长期生存的关键。因此，临床上迫切需要探索肝癌转移复发的相关预测指标来优化治疗方案。对病人预后的准确评估可对高危转移复发病人增强辅助治疗或采用侵袭性较小的治疗方案，对低危转移复发病人避免过度治疗，从而使实现治疗个体化，提高病人的生活质量。传统意义上的预后预测指标为肿瘤的临床病理分期和肿瘤细胞分化分级，该分期和分级能大致反映不同病人术后生存率的差别。但这些临床病理特征并不能准确预测转移复发和病人预后。生物标记物可提供更多信息，有望准确预测转移复发。与肿瘤侵袭转移相关的因素均有望成为转移复发的预测标记物。生物标记可在组织和体液中检测，体液(特别是血液)检测不需肿瘤组织标本、技术相对简单、便于在同一患者多次重复进行，易于被患者接受，对于预测转移复发的可能性更为重要。外周血中癌细胞“特异性”标记(如AFP，MAGE、CK19等)mRNA和蛋白检测，以及外周血循环DNA及其遗传学异常等均已被用于转移复发的预测。另一重要方面——外周血循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTC)的检测也已成为近年来研究的热点。已发现CTC与多种肿瘤病人的预后相关。但其在肝癌病人中的应用价值尚有争论，主要是因为采用的检测方法、标记分子及引物、对象人群和样本采集的部位与时间不同。CTC的检测与分离技术有多种。根据肿瘤细胞大于血液中有核细胞的原理分离和富集CTC的方法较为敏感、简捷，避免了其它分离过程中引起的细胞丢失，且不破坏细胞形态。本研究中我们采用该方法检测HCC病人外周血中的CTC，并联合单细胞全基因组扩增技术和比较基因组杂交技术(CGH)研究CTC中遗传学异常，并探讨手术对CTC影响及CTC在预测肿瘤术后近期复发中的作用。肝癌病人外周血循环肿瘤细胞的检测方法的建立及临床应用目的：建立一种循环肿瘤细胞(CTC)的检测方法，检测肝癌外周血的CTC及探讨手术对肝癌病人外周血中CTC数目的影响。方法：建立全血滤过富集技术检测外周血中CTC。应用肝癌细胞株HCC97-L经滤过富集后测定肿瘤细胞的检出率以检测该方法的敏感性，采用该方法检测术前75例肝细胞癌(HCC)患者、15例良性病变病人和10例正常健康对照外周血中CTC。其中18例HCC、10例血管瘤和1例局灶性结节状增生病人术中再次取血检测CTC。用细胞角蛋白8／18(CK8／18)行免疫荧光检测结合显微镜下形态学观察，判断并计数肿瘤细胞。结果：HCC97-L细胞检出率在40％～100％之间，平均为68％；75例HCC病人外周血标本中有43(57.3％)例为CTC阳性，细胞数在1～23之间，其中早期肝癌35例中10例28.6％。对照组为血管瘤例10，局灶性结节状增生1例，肝囊肿4例，术前均未发现CK阳性CTC。18例HCC病人术中检出率为100％，明显高于术前(61％)，且术中CTC数目也明显多于术前(分别为20.1个和1.2个)，二者之间差别有显著意义(P＜0.01)。血管瘤和局灶性结节状增生病例术后可见CK阳性细胞0～1个。结论：全血滤过富集法能简单、快速、有效的检出肝癌病人外周血中CTC，手术操作明显增加肝癌病人外周血中CTC数目。循环肿瘤细胞的染色体基因组异常研究目的：检测HCC病人CTC的染色体基因组的非平衡性改变，探讨采用比较基因组杂交间接证明单个CTC的良恶性的可行性。方法：采用激光捕获显微切割技术(LCM)分离来自第一部分早期(TNMⅠ-Ⅱ期)HCC病例中14个和晚期HCC病例(TNMⅢ-Ⅳ期)中的16个循环肿瘤细胞，单细胞全基因组扩增技术扩增所有分离的单个细胞的全基因组DNA，采用比较基因组杂交技术(CGH)检测细胞的染色体基因组异常。结果：激光捕获显微切割30个成功29个，成功率97％；单细胞扩增29个成功27个，成功率93％；CGH结果显示27个单细胞中有22个有不同程度的染色体改变，其中早期病例13个细胞中9个有染色体异常，晚期病例14个中有13个有染色体异常。CTC中常见的扩增位置有1q、6p、8q，常见的缺失有1p、4q、8p、13q、16q、17p。其中9个早期肝癌CTC中有1个存在8p缺失，13个晚期肝癌CTC中有8个存在8p缺失，二者之间的差别有显著统计学意义(P＜0.01)。结论：单细胞全基因组扩增产物可用于比较基因组杂交。比较基因组杂交技术可以间接证明单个CTC的良恶性，大部分CTC有基因组的改变。肝癌循环肿瘤细胞中最常见1q、6p、8q扩增的和1p、4q、8p、13q、16q、17p的缺失。肝细胞癌患者外周血中循环肿瘤细胞的临床意义和预后价值研究目的：探讨CTC在HCC外周血中的临床意义和预后价值。方法：采用滤过富集法检测75例HCC患者、15例良性病变病人和10例正常健康对照的外周血中CTC，用细胞角蛋白8／18(CK8／18)行免疫荧光检测结合显微镜下形态学观察，判断并计数肿瘤细胞。结果：HCC早期(Ⅰ-Ⅱ期)病人，CTC的阳性率为28.6％；晚期(Ⅲ-Ⅳ期)时，为82.5％。两者差异有统计学意义(P＜0.01)。HBsAg、血清AFP水平、肝硬化、有无包膜和Edmondson分级与CTC数目无关(P＞0.05)；单发肿瘤63例中33例阳性，多发肿瘤12例10例阳性，两组之间差异具有统计学意义(P＜0.05)；大肿瘤组(＞5cm)38例中30例阳性，小肿瘤组(≦5cm)37例中13例阳性，两组之间差异具有统计学意义(P＜0.01)；外周血中检测到CTC与肝癌病人术后一年总体生存率和无瘤生存率的减少有关。结论：全血滤过富集法检测肝癌外周血CTC发现部分早期肿瘤已有肿瘤细胞的血源性播散；随着肿瘤进展血中肿瘤细胞也增加；外周血中检测到CTC提示病人的近期预后较差。
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全文目录
中文摘要 5-9
英文摘要 9-14
前言 14-22
第一部分 肝癌病人外周血循环肿瘤细胞的检侧方法的建立及临床应用 22-35
中文摘要 22
前言 22-23
材料与方法 23-25
结果 25-27
讨论 27-30
小结 30-31
参考文献 31-35
第二部分 循环肿瘤细胞的染色体基因组异常研究 35-60
中文摘要 35
前言 35-36
材料和方法 36-41
结果 41-52
讨论 52-56
小结 56
参考文献 56-60
第三部分 肝细胞癌患者外周血中循环肿瘤细胞的临床意义和预后价值研究 60-74
中文摘要 60
前言 60
材料与方法 60-61
结果 61-67
讨论 67-70
小结 70
参考文献 70-74
全文总结 74-75
创新点 75
本研究的潜在应用价值 75-76
文献综述 76-90
附件 90-91
致谢 91-93
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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肝肿瘤
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