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桔小实蝇AChE的分离纯化及生化毒理学特性研究

作　者: 王晓娜
导　师: 王进军
学　校: 西南大学
专　业: 农业昆虫与害虫防治
关键词: 桔小实蝇发育阶段乙酰胆碱酯酶纯化生物化学毒理学
分类号: S433
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

本学位论文以桔小实蝇Bactrocera dorsalis为研究对象,采用局部点滴法测定了桔小实蝇不同地理种群对马拉硫磷、高效氯氰菊酯和阿维菌素3种常用杀虫剂的敏感性；在此基础上,采用普鲁卡因胺（Procainamide）亲和层析法,成功分离纯化了桔小实蝇不同地理种群和不同发育阶段体内的乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase, AChE）,并从昆虫生理生化角度系统分析了桔小实蝇不同地理种群和不同发育阶段AChE的生化毒理学特性。研究工作得到了国家973计划前期研究专项（2009CB125903）和重庆市杰出青年科学基金项目（CSTC2009BA1042）的资助,经过2年多的研究,获得的主要结果如下：1桔小实蝇不同地理种群和不同发育阶段AChE的纯化采用普鲁卡因胺亲和层析法成功地从桔小实蝇不同地理种群和不同发育阶段虫体内分离纯化了AChE。各地理种群的纯化倍数均达到500倍以上。其中,桔小实蝇东莞种群AChE的纯化倍数最高（561倍）,昆明种群次之（546倍）,广州种群（510倍）和海口种群（509倍）的纯化倍数相对最低；东莞、昆明、广州和海口种群的AChE回收率分别为53.2%、43.9%、57.1%和57.3%。桔小实蝇不同发育阶段AChE的纯化指数亦不相同。其中,3龄幼虫AChE的纯化倍数最高（584倍）,蛹期次之（530倍）,成虫最低（505倍）,3龄幼虫、蛹和成虫期AChE的回收率分别为56.3%、53.3%和48.5%。纯化后的酶液经SDS-PAGE检测,均显示单一条带,分子量均为58 KD,达到电泳纯水平。2桔小实蝇不同地理种群和不同发育阶段AChE生化毒理学特性研究2.1生物测定采用局部点滴法测定了桔小实蝇东莞、广州、海口和昆明4个地理种群对马拉硫磷、阿维菌素和高效氯氰菊酯的敏感性。生物测定结果表明,桔小实蝇4个地理种群对马拉硫磷的敏感性差异显著,其中东莞种群对该药剂相对最不敏感,其次依次为广州、海口和昆明种群；东莞、广州和海口种群对阿维菌素的敏感性无显著性差异,但与昆明种群间差异显著；除广州和海口种群对高效氯氰菊酯的敏感性无显著性差异外,其它种群对高效氯氰菊酯的敏感性均有显著性差异。3种药剂间相比较,桔小实蝇对马拉硫磷最不敏感,对阿维菌素相对最敏感。因此,推测在实际田间药剂防治中,阿维菌素对桔小实蝇的防治效果可能会优于马拉硫磷和高效氯氰菊酯。2.2桔小实蝇不同地理种群AChE生化毒理学特性研究通过对纯化后的AChE酶促反应的最适温度和最适pH进行测定发现,桔小实蝇4个地理种群AChE均在pH 7.4时活力达到峰值,4个地理种群理论最适pH分别为：东莞种群7.38、广州种群7.39、海口种群7.44、昆明种群7.45；不同地理种群AChE在温度为37℃时活力最高,理论最适温度分别为：东莞种群36.0℃、广州种群36.6℃、海口种群36.8℃、昆明种群36.3℃。比较桔小实蝇不同地理种群AChE的动力学参数发现,4个地理种群的米氏常数（K_m）和最大反应速率（Vmax）差异显著。其中东莞种群K_m相对最高,Vmax相对最低,说明东莞种群AChE对底物的亲和力最弱,对底物的水解能力最差。离体抑制结果表明,6种抑制剂（毒扁豆碱、乙基对氧磷、残杀威、BW284C51、涕灭威和毒死蜱）对桔小实蝇不同地理种群AChE均有良好的抑制效果。比较抑制中浓度I₅₀和双分子速率常数K_i发现,桔小实蝇各种群均对毒扁豆碱的抑制作用最敏感,而毒死蜱的抑制效果最差。东莞种群相对其它3个种群对抑制剂的抑制作用最不敏感。2.3桔小实蝇不同发育阶段AChE生化毒理学特性研究对纯化后的AChE酶促反应的最适温度和最适pH进行测定发现,桔小实蝇不同发育阶段AChE在pH 7.4时活力最高,其理论最适pH分别为：3龄幼虫期为7.39、蛹期为7.35、成虫期为7.45。各发育阶段AChE均约在37℃时活力最高,理论最适温度分别为：3龄幼虫期36.5℃、蛹期37.0℃、成虫期36.8℃。比较桔小实蝇不同发育阶段AChE的动力学参数发现,3个发育阶段的米氏常数和最大反应速率差异显著。其中成虫期K_m相对最高,Vmax相对最低,说明桔小实蝇成虫对底物的亲和力最弱,水解能力最差；幼虫期K_m相对最低,Vmax相对最高,说明桔小实蝇幼虫对底物的亲和力最强,水解能力也最强。离体抑制结果发现,6种抑制剂（毒扁豆碱、乙基对氧磷、残杀威、BW284C51、涕灭威和毒死蜱）对桔小实蝇不同发育阶段AChE均具有良好的抑制效果。通过比较抑制中浓度I₅₀和双分子速率常数K_i发现,桔小实蝇不同发育阶段的AChE均对毒扁豆碱的抑制作用最敏感,而毒死蜱的抑制效果最差。3个发育阶段相比较,成虫期AChE对抑制剂的抑制作用最不敏感。综合来看,桔小实蝇不同地理种群和不同发育阶段AChE生化和毒理学特性存在差异的原因可能与各种群和各发育阶段AChE对药剂的敏感性差异有关,而这与各地施药水平及各发育阶段的靶标调控机制密不可分。

全文目录

摘要  8-10
Abstract  10-13
第一章文献综述  13-21
  1 桔小实蝇  13
    1.1 桔小实蝇的分布危害  13
    1.2 桔小实蝇的抗药性研究概况  13
  2 乙酰胆碱酯酶  13-21
    2.1 乙酰胆碱酯酶的抗药性机理研究  13-14
    2.2 酶促反应动力学  14-16
    2.3 昆虫AChE的分离纯化  16-21
引言  21-23
第二章桔小实蝇乙酰胆碱酯酶的分离纯化  23-37
  1 材料与方法  23-28
    1.1 实验虫源  23
    1.2 主要供试药剂及仪器  23-24
    1.3 主要试剂配制  24
    1.4 procainamide亲和层析柱制备  24-25
    1.5 桔小实蝇AChE的纯化  25-26
    1.6 蛋白含量测定  26
    1.7 桔小实蝇AChE的活性测定  26-27
    1.8 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)  27-28
  2 结果与分析  28-34
    2.1 桔小实蝇不同地理种群AChE的分离纯化  28-31
    2.2 桔小实蝇不同发育阶段AChE的分离纯化  31-34
  3 讨论  34-37
第三章桔小实蝇乙酰胆碱酯酶生化及毒理学特性研究  37-63
  1 材料与方法  37-42
    1.1 供试虫源  37
    1.2 供试酶源  37
    1.3 主要供试药剂及仪器  37-40
    1.4 生物测定  40
    1.5 AChE活力的测定  40
    1.6 pH对纯化后AChE活力的影响  40-41
    1.7 温度对纯化后AChE活力的影响  41
    1.8 AChE底物特异性与动力学参数K_m和V_(max)的测定  41
    1.9 抑制剂对AChE的离体抑制作用  41-42
  2 结果与分析  42-60
    2.1 桔小实蝇生物测定结果  42-43
    2.2 桔小实蝇不同地理种群AChE的生化毒理学特性  43-52
    2.3 桔小实蝇不同发育阶段AChE的生化毒理学特性  52-60
  3 讨论  60-63
第四章主要结论与研究展望  63-65
  1 主要结论  63-64
  2 研究展望  64-65
参考文献  65-75
在读期间发表的论文  75-77
致谢  77-78

桔小实蝇AChE的分离纯化及生化毒理学特性研究

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