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坛紫菜R-藻红蛋白的分离纯化工艺与分析鉴定

作　者: 王翠芹
导　师: 王长海；顾铭
学　校: 大连理工大学
专　业: 生物化工
关键词: 粗提技术离子交换色谱凝胶过滤色谱坛紫菜R-藻红蛋白分离纯化
分类号: TQ936
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

藻红蛋白作为坛紫菜中的一种重要生理活性物质,已广泛应用到食品、轻工业、化妆和医药等行业,具有很高的经济价值。目前藻红蛋白主要是从红藻中分离提取获得,现已报道的分离纯化工艺多为破壁粗提,盐析沉淀粗分离再结合多步色谱层析纯化获得,这种工艺存在多种问题,比如细胞破碎不充分,提取效率较低、盐析沉淀操作步骤繁琐、多步柱层析成本较高等等,使得藻红蛋白生产难以工业化,高纯度藻红蛋白价格十分昂贵,极大限制了藻红蛋白的广泛应用。故本文针对坛紫菜R-藻红蛋白分离纯化存在的一系列问题,对比了多种破壁粗提技术并加以条件优化,结合两步色谱层析,建立了坛紫菜R-藻红蛋白分离纯化新工艺,为藻红蛋白大规模开发和利用提供了理论基础和科学依据。(1)坛紫菜R-藻红蛋白是胞内蛋白,破壁技术作为藻红蛋白提纯的第一步直接关系到原料的利用率和藻红蛋白的生产成本,具有十分重要的意义。故本研究比较了4种具有大规模提取应用前景的粗提技术——溶胀法、化学处理法、超声波法和搅切法对坛紫菜R-藻红蛋白的提取效果,以R-藻红蛋白提取得率、纯度和提取时间为参数,确定搅切法为最佳粗提技术,并对这种方法的物料比、搅切转速和搅切时间进行了优化,结果表明当物料比为1：30,搅切速度18000rpm下作用5-6min,即可获得较高得率和纯度的R-藻红蛋白粗提液。(2)针对盐析沉淀粗分离步骤繁琐、高纯度藻红蛋白制备多步色谱层析成本较高,难以实现藻红蛋白工业化生产,直接选用可应用于工业化生产规模的离子交换介质和凝胶过滤介质进行柱层析,结合超滤浓缩分离纯化R-藻红蛋白粗提液,并对离子交换层析介质种类、缓冲液种类、pH及洗脱方法进行比较优化,最后确定Q Sepharose FF离子交换介质,50mmol/L磷酸钠缓冲液(pH6.0)为初始缓冲液,采用洗脱液盐浓度分步洗脱(0-0.10-0.35-1.00mol/L NaCl),收集盐浓度为0.35mol/L时的颜色馏分；50kDa超滤膜对其超滤浓缩纯化；浓缩后上样Sephacryl S-300 HP层析柱,50mmol/L磷酸钠缓冲液(pH7.0、0.15mol/L NaCl)作为流动相,流速为0.7mL/min,得到纯度为11.23的目标馏分。对凝胶过滤层析收集目标馏分进行光谱分析鉴定,结果显示该馏分在565nm和498nm处各有一特征吸收峰,在540nm处有一肩峰,荧光发射峰位于576nm,而且符合高纯度R-藻红蛋白的三个指标：A565/A280>4.0、A620/A565<0.02和A565/A498.5>1.5。非变性电泳图谱出现一个条带,变性电泳图谱出现两条带,它们分子量分别是16.0kDa和18.0kDa,均与R-藻红蛋白标品条带一致,故目标馏分为高纯度的坛紫菜R-藻红蛋白。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-8
目录  8-11
引言  11-12
1 文献综述  12-24
  1.1 藻红蛋白的概论  12-17
    1.1.1 藻红蛋白与藻胆蛋白  12-13
    1.1.2 藻红蛋白的结构与组成  13-15
    1.1.3 藻红蛋白的分类  15-16
    1.1.4 藻红蛋白的理化性质  16-17
  1.2 藻红蛋白的应用  17-19
    1.2.1 在免疫荧光技术方面的应用  17-18
    1.2.2 在食品行业和精细化工方面的应用  18
    1.2.3 在医药保健药物开发方面的应用  18-19
  1.3 藻红蛋白的提取与粗分离  19-21
    1.3.1 破壁粗提  19-20
    1.3.2 粗制方法  20-21
  1.4 藻红蛋白的分离纯化  21-22
    1.4.1 吸附层析  21-22
    1.4.2 离子交换层析  22
    1.4.3 凝胶柱层析  22
  1.5 本文研究内容及技术路线  22-24
2 坛紫菜R-藻红蛋白的粗提技术的比较  24-36
  2.1 材料与方法  24-25
    2.1.1 材料与试剂  24
    2.1.2 仪器及设备  24
    2.1.3 细胞破碎方法  24-25
    2.1.4 坛紫菜R-藻红蛋白得率和纯度的计算  25
  2.2 结果与讨论  25-35
    2.2.1 溶胀法  25-27
    2.2.2 化学处理法  27-29
    2.2.3 超声破碎法  29-32
    2.2.4 搅切法  32-35
  2.3 本章小结  35-36
3 坛紫菜R-藻红蛋白的分离纯化工艺的建立  36-55
  3.1 材料与方法  36-38
    3.1.1 材料与试剂  36
    3.1.2 仪器与装置  36-37
    3.1.3 实验方法  37-38
  3.2 结果与讨论  38-53
    3.2.1 离子交换介质种类的选择  39-40
    3.2.2 缓冲液种类的选择  40-42
    3.2.3 起始缓冲液pH的优化  42-44
    3.2.4 洗脱液盐浓度的优化  44-47
    3.2.5 上样体积的优化  47
    3.2.6 洗脱流速的优化  47-48
    3.2.7 离子交换层析的放大  48-49
    3.2.8 不同孔径超滤膜的选择  49-50
    3.2.9 凝胶过滤层析  50-53
  3.3 本章小结  53-55
4 坛紫菜R-藻红蛋白的分析鉴定  55-65
  4.1 材料与方法  55-58
    4.1.1 材料与试剂  55
    4.1.2 仪器与设备  55
    4.1.3 实验方法  55-58
  4.2 实验结果  58-63
    4.2.1 紫外可见吸收光谱分析  58-60
    4.2.2 荧光光谱分析  60-62
    4.2.3 Native和SDS-PAGE电泳分析  62-63
  4.3 本章小结  63-65
结论与展望  65-67
参考文献  67-71
攻读硕士学位期间发表学术论文情况  71-72
致谢  72-73

坛紫菜R-藻红蛋白的分离纯化工艺与分析鉴定

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