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四种食源性致病菌多重PCR检测方法的建立

作　者: 孙鸿燕
导　师: 刘娅
学　校: 吉林大学
专　业: 营养与食品卫生
关键词: 食源性致病微生物多重PCR 快速检测正交实验
分类号: R155.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

近年来,全球食品安全恶性事件频发,成为影响公共健康的重要因素,食品安全问题越来越成为社会关注的热点。我国流行的食源性疾病中,细菌性食物中毒居首位,因此,食品中病原性细菌检测是食品卫生安全检测中一个重要的部分。目前检测食源性致病菌主要采用分离、培养然后生化鉴定的方法,不仅操作繁琐,检测周期较长,且每次只能检出一种细菌,一般需要一周左右才能提交检测报告,而且敏感度、特异性均较低。面对日益增加的多重混合污染,目前的检测方法显得滞后,因此建立快速、高效、准确的食源性致病菌的检测方法变得越来越迫切。多重PCR是在同一个PCR反应体系中同时加入了多对引物,从而实现了在同一体系中对多个目的片段的同时扩增,克服了常规PCR方法一次只能扩增个目的片段的缺点,从而为实现多种食源性致病菌的快速同时检测,节省了成本和时间,多重PCR检测方法有着更为广阔的发展空间。为建立一种同时检测四种常见致病菌的PCR方法,设计并筛选4对特异性引物,PCR扩增的目的基因片段长度分别为366bp、113bp、155bp、283bp。首先建立单重PCR检测体系,对标准菌株进行扩增并确定检测的特异性和灵敏度。经测序验证其同源性高达99%,特异性良好,灵敏度达101cfu/ml,从而为下步多重PCR检测体系的建立奠定了基础。建立多重PCR反应体系,根据影响多重PCR的主要因素,引物浓度,dNTP浓度,Taq酶浓度,Mg2+浓度设计了L9(34)正交实验寻找最优的反应条件,并对退火温度进行了优化。最终反应体系50μ1。同时建立了两步法PCR扩增体系和循环条件,结果表明这4株致病菌均有清晰、特异的目标条带,志贺氏菌和单增李斯特菌的灵敏度达到l01cfu/ml,0157：H7和金黄色葡萄球菌的敏感性达到了102cfu/ml,因此,本研究所建立的检测四种病原菌的多重PCR体系的灵敏度达到了1.8×103cfu/ml。同时以国标法为对照,对人为接种致病菌的牛奶样品进行检测,和送检商品等样本共84份进行多重PCR检测,样品检测前用LB增菌液进行前增菌,结果表明,采用多重PCR方法简单快速且灵敏度高,整个检测时间在24 h以内,与国标法相比,应用多重PCR在84份样品检测中无假阴性,假阳性低于2%。本实验建立的多重PCR方法灵敏度高,特异性好,可以实现对样品的快速检测,在检测食品中志贺氏菌,金黄色葡萄球菌,肠出血性大肠杆菌0157：H7,单核细胞增生性李斯菌中有广阔的应用前景,同时对控制病原菌传播,预防食物中毒的发生也有积极意义。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-12
第1章绪论  12-27
  1.1 食源性疾病及流行现状  12-13
  1.2 四种食源性致病菌及其危害  13-19
    1.2.1 志贺氏菌  13-15
    1.2.2 单核细胞增生性李斯特菌  15-16
    1.2.3 金黄色葡萄球菌  16-18
    1.2.4 大肠杆菌O157:H7  18-19
  1.3 食源性致病菌检测方法  19-24
    1.3.1 传统检测方法  19-20
    1.3.2 免疫学检测方法  20-22
    1.3.3 分子生物学检测方法  22-24
  1.4. 本研究中的分子生物学靶点  24-25
    1.4.1 志贺氏菌侵袭性质粒抗原H基因  24-25
    1.4.2 金黄色葡萄球菌nuc基因  25
    1.4.3 O157:H7 hlyA基因  25
    1.4.4 单增李斯特菌hlyA基因  25
  1.5 研究目的和任务  25-27
第2章四种常见肠道病原菌单重PCR检测方法的建立  27-41
  2.1 实验材料  27-28
    2.1.1 实验菌株及编号  27
    2.1.2 主要的试剂和培养基  27-28
    2.1.3 实验仪器  28
  2.2 实验方法  28-32
    2.2.1 致病菌DNA提取方法  28-30
    2.2.2 特异性基因的选择及引物设计  30
    2.2.3 单重PCR反应体系的建立  30-31
    2.2.4 单重PCR灵敏度和特异性的测定  31-32
  2.3 实验结果  32-38
    2.3.1 三种方法提取DNA浓度和纯度的比较结果  32-33
    2.3.2 单重PCR反应体系的建立  33-34
    2.3.3 单重PCR灵敏度和特异性的测定结果  34-38
  2.4 讨论  38-41
    2.4.1 致病菌DNA提取方法  38-39
    2.4.2 单重PCR特异性和敏感性  39-41
第3章四种常见肠道病原菌多重PCR检测方法的建立  41-55
  3.1 实验材料  41-42
    3.1.1 实验试剂  41-42
    3.1.2 实验仪器  42
  3.2 实验方法  42-45
    3.2.1 四种致病菌多重PCR检测方法的建立和优化  42-44
    3.2.2 多重PCR灵敏度和特异性的测定  44
    3.2.3 人工感染牛奶中的应用  44
    3.2.4 多重PCR检测方法对市售食品的检验  44-45
    3.2.5 两步法多重PCR反应体系的建立  45
  3.3 实验结果  45-50
    3.3.1 四种致病菌多重PCR检测方法的建立  45-46
    3.3.2 交实验优化多重PCR实验条件  46-47
    3.3.3 温度优化结果  47
    3.3.4 多重PCR灵敏度和特异性的测定结果  47-48
    3.3.5 人工感染牛奶样品中的应用  48-49
    3.3.6 多重PCR检测方法和国标方法对送检食品的检验结果比较  49
    3.3.7 两步法多重PCR反应体系的建立结果  49-50
  3.4 讨论  50-55
    3.4.1 多重PCR影响因素  50-52
    3.4.2 正交实验优化多重PCR  52
    3.4.3 多重PCR敏感性和特异性  52-54
    3.4.4 两步法反应体系的建立  54-55
第4章结论  55-56
参考文献  56-61
致谢  61

四种食源性致病菌多重PCR检测方法的建立

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