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瓜类细菌性果斑病菌及辣椒细菌性斑点病菌的快速检测技术研究

作　者: 董明明
导　师: 刘爱新
学　校: 山东农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 细菌性果斑病细菌性斑点病快速检测 GICA-PCR 实时荧光PCR
分类号: S436.418
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

植物病原细菌可导致多种严重的植物病害,引起多种农作物、花卉及林木等植物产量、质量等严重受损甚至绝产,因此,任何快速、准确的检测植物病原细菌的方法对防止该病害的发生、流行等环节都是有意义的。瓜类细菌性果斑病菌(Acidovorax avenae subsp. citrulli,Aac)是西瓜、甜瓜及哈密瓜等瓜类作物上重要的植物病原细菌,可导致西瓜等作物严重减产甚至整株死亡,在美国被称为西瓜的“癌症”,是典型的种传病害,被列为我国进境植物检疫性有害生物之一。目前,该病害已在我国境内部分地区发生,且危害严重,探索快速、有效的检测瓜类果斑病菌的方法迫在眉睫。番茄及辣椒细菌性斑点病(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria,Xcv)是番茄及辣椒上重要的病原菌之一,是典型的种传病害,危害十分严重。该病菌广泛分布于亚、非、欧、美等部分国家和地区,被欧洲及地中海植物保护组织列为A2类检疫性有害生物,建立特异、灵敏的检测技术对保证我国辣椒进出口贸易安全意义重大。本研究中,利用GICA-PCR技术和实时荧光PCR技术分别对瓜类细菌性果斑病菌和辣椒细菌性斑点病菌进行了检测研究,主要研究内容如下:(1)胶体金免疫层析试纸条检测方便、快捷,整个反应仅需几分钟时间,应用十分广泛,但试纸条若使用不当可能会出现假阳性现象,仅适用于对病原菌的初筛。本研究将胶体金免疫层析方法(GICA)与PCR技术结合,建立了GICA-PCR检测Aac病菌的方法。检测结果表明,该方法在蛋白质与核酸两个方面,提高了瓜类果斑病菌试纸条检测的准确性和灵敏度,有效解决了试纸条检测的假阳性问题,并可以从发病的西瓜叶片上检测到果斑病菌。因此,所建立的GICA-PCR方法值得在口岸局检测中推广和应用。(2)实时荧光PCR较普通PCR方法特异性强、灵敏度高,节省了反应结束后的电泳的步骤,避免了溴化乙锭或其他核酸染料的污染,并可实时观察扩增反应的产物量变化。本研究针对辣椒寄主的Xcv病菌rhs家族基因的序列片段,设计了一对引物及探针XCV-F-F/R/P,特异性检测辣椒细菌性斑点病菌。所建立的实时荧光PCR检测体系扩增Xcv基因片段的长度为71 bp,最低可检测菌液的浓度为9×10~3 cfu/ml,检测DNA的极限浓度为2.8×10~4 copies/ml,二者灵敏度相似,且均比普通PCR的灵敏度高约10倍。经实验可证明,该荧光PCR体系可以达到特异性检测受侵染的辣椒植株及种子的要求,适合作为快速、可靠地检测被Xcv侵染样品的方法。本文所建立的GICA-PCR及实时荧光PCR检测体系,经实验证实快速、灵敏、准确,解决了上述两种细菌在实际检测中的技术难题,可以在相关部门推广,有助于保证我国生态环境及进出口贸易安全。

全文目录

摘要  7-9
Abstract  9-11
1 引言  11-40
  1.1 植物病原细菌概述  11
  1.2 植物病原细菌的形态特征  11-13
  1.3 植物病原细菌引起的病害症状  13
  1.4 植物病原细菌的传统检测方法  13-17
    1.4.1 柯赫氏法则  13-14
    1.4.2 过敏性坏死反应  14
    1.4.3 革兰氏染色法  14-15
    1.4.4 培养性状鉴定  15-16
    1.4.5 生理生化鉴定  16-17
  1.5 植物病原细菌的血清学检测技术  17-21
    1.5.1 免疫凝集和沉淀反应  17-18
    1.5.2 免疫荧光技术  18-19
    1.5.3 酶联免疫吸附测定  19
    1.5.4 斑点免疫结合测定  19-21
    1.5.5 其他血清学方法  21
  1.6 植物病原细菌的分子生物学检测技术  21-32
    1.6.1 PCR 及相关检测技术  21-29
      1.6.1.1 免疫捕捉PCR  22-23
      1.6.1.2 实时荧光定量PCR  23-27
        1.6.1.2.1 荧光PCR 的原理  23-26
        1.6.1.2.2 TaqMan 探针法  26-27
      1.6.1.3 环介导等温扩增技术  27
      1.6.1.4 其他PCR 相关技术  27-29
    1.6.2 基因芯片  29-30
    1.6.3 核酸杂交技术  30-32
    1.6.4 其他分子生物学检测技术  32
  1.7 瓜类细菌性果斑病检测技术  32-36
    1.7.1 瓜类细菌性果斑病概述  32
    1.7.2 分类地位  32-33
    1.7.3 症状  33-34
    1.7.4 寄主与分布  34
    1.7.5 生物学性状  34-35
    1.7.6 检测技术  35-36
  1.8 辣椒细菌性斑点病检测技术  36-39
    1.8.1 生物学性状  37
    1.8.2 症状及防治  37
    1.8.3 检测技术  37-39
  1.9 研究的目的及意义  39-40
2 材料与方法  40-47
  2.1 菌种材料  40-41
  2.2 主要试剂  41-42
  2.3 主要仪器  42
  2.4 方法  42-47
    2.4.1 GICA-PCR 检测瓜类细菌性果斑病菌  42-43
      2.4.1.1 免疫金试纸条检测瓜类果斑病菌  42-43
      2.4.1.2 PCR 检测接种 Aac 发病的西瓜种苗 DNA  43
      2.4.1.3 免疫金试纸条检测接种Aac 的西瓜种苗  43
    2.4.2 实时荧光PCR 检测辣椒细菌性斑点病菌  43-47
      2.4.2.1 实时荧光PCR 引物及探针的设计与合成  43-45
      2.4.2.2 实时荧光PCR 特异性检测  45
      2.4.2.3 实时荧光PCR 灵敏度检测  45-46
      2.4.2.4 荧光PCR 检测接种的辣椒植株  46
      2.4.2.5 荧光PCR 检测模拟带菌辣椒种子浸泡液  46
      2.4.2.6 荧光PCR 检测田间疑似辣椒样品  46-47
3 结果与分析  47-61
  3.1 GICA-PCR 检测 Aac 病菌  47-48
    3.1.1 GICA 试纸条检测 Aac 病菌  47
    3.1.2 PCR 检测接种西瓜总 DNA  47-48
    3.1.3 GICA-PCR 检测接种西瓜叶片  48
  3.2 实时荧光PCR 检测辣椒细菌性斑点病菌  48-61
    3.2.1 荧光PCR 特异性检测  48-53
    3.2.2 荧光PCR 灵敏度检测  53-56
      3.2.2.1 以菌液为模板的灵敏度检测  53-54
      3.2.2.2 以 DNA 为模板的灵敏度检测  54-56
    3.2.3 荧光PCR 与普通PCR 灵敏度比较  56-57
    3.2.4 荧光PCR 检测接种发病的辣椒植株  57-59
    3.2.5 荧光PCR 检测模拟带菌辣椒种子浸泡液  59
    3.2.6 荧光PCR 检测田间发病辣椒样品  59-61
4 讨论  61-64
  4.1 GICA-PCR 检测瓜类细菌性果斑病菌  61-62
  4.2 实时荧光PCR 检测辣椒细菌性斑点病菌  62-64
5 总结与展望  64-66
  5.1 全文总结  64-65
  5.2 研究展望  65-66
6 参考文献  66-76
7 附录  76-77
8 致谢  77-78
9 攻读学位期间发表论文情况  78-79
硕士学位论文内容简介及自评  79

瓜类细菌性果斑病菌及辣椒细菌性斑点病菌的快速检测技术研究

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