学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

利用多重PCR一次检测侵染大豆的几种检疫性病毒及大豆内源基因的研究

作　者: 易汪雪
导　师: 陈舜胜
学　校: 上海海洋大学
专　业: 食品科学与工程
关键词: 菜豆荚斑驳病毒烟草环斑病毒番茄环斑病毒内源基因多重RT-PCR 实时荧光PCR
分类号: S435.651
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 17次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

大豆作为世界上最为重要的一种经济作物,每年在各个国家都有大宗的贸易份额,在其生长过程中会受到多种真菌、细菌、病毒、线虫、昆虫等病原物的侵染。菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus, BPMV)、烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus, TRSV)和番茄环斑病毒(Tomato ringspot virus, ToRSV)均是危害大豆的重要病毒,也是我国的主要检疫对象,建立其多重PCR的快速检测体系,提高病毒的检测效率,为快验快放服务。本研究以带有BPMV、TRSV和ToRSV的大豆种子为实验材料,根据BPMV、TRSV、ToRSV的CP基因设计合成多对引物,然后进行单基因PCR反应特异性验证,同时选择大豆内源基因(BD30K)作为参照物,确保RNA提取、cDNA第一链合成及PCR等过程被正确操作,防止假阴性结果的发生。在此基础上合理组合各对引物并调整、优化多重PCR反应条件,最终确立了四对特异性引物和多重PCR的反应条件,选用的引物分别可扩增BPMV 275bp,TRSV 580bp,ToRSV 794bp,BD30K 104bp的特异性片段,反应条件则在普通PCR的基础上调整反应缓冲液浓度至1.4X,BD30K的引物浓度为其他引物的2倍,在此条件下我们建立了同时检测大豆种子中BPMV、TRSV、ToRSV及大豆内源基因BD30K的多重RT-PCR体系。研究结果表明,同步检测的特异性和灵敏度均好;能够检测到BPMV、TRSV、ToRSV和BD30K的RNA最低含量分别为0.9ng、0.186ng、8.0pg、3.8ng;携带三种病毒的大豆种子混合后提取的RNA的最低检测含量为1.16ng。表明建立的多重PCR检测方法特异性强,灵敏度高,可操作性强,大大缩短了检测时间,简化了操作步骤,具有较强的应用价值,适合口岸对进境大豆种子中这3种病毒的快速检测,在出入境检验检疫中具有广泛的应用前景。本研究还建立了大豆种子中BPMV和TRSV单管双重实时荧光PCR检测方法。将含有相同浓度的分别带有BPMV和TRSV CP基因的质粒溶液作为阳性对照,以受2种病毒侵染的大豆种子作为实验样品进行实时荧光PCR检测,结果表明能从同一管中同时检测出这两种病毒而不发生交叉反应。尽管在阳性对照中,二者的检测限相当,均可达到35 pg/mL,但在实际应用中,两种病毒由于在大豆种子中的浓度不一致而存在一定的差别。同时将实时荧光灵敏度与DAS-ELISA和RT-PCR检测灵敏度进行比较,结果表明实时荧光PCR检测BPMV和TRSV的灵敏度分别是DAS-ELISA灵敏度的103、106倍;是双重RT-PCR灵敏度的100倍。可见双重实时荧光技术在病毒检测方面有着广阔的应用前景,同时该方法的建立在农业生产、种子流通及种子检验检疫中具有重大意义。

全文目录

摘要  2-4
ABSTRACT  4-8
引言  8-10
第一章文献综述  10-22
  1.1 大豆种传检疫性病毒介绍  10-13
    1.1.1 菜豆荚斑驳病毒  10
    1.1.2 烟草环斑病毒  10-11
    1.1.3 番茄环斑病毒  11-12
    1.1.4 南芥菜花叶病毒  12
    1.1.5 南方菜豆花叶病毒  12
    1.1.6 花生矮化病毒  12-13
  1.2 植物病毒的主要检测方法  13-20
    1.2.1 指示植物接种方法  13
    1.2.2 血清学检测  13-14
    1.2.3 电子显微镜技术  14-15
    1.2.4 分子生物学技术  15-18
    1.2.5 生物芯片技术  18-20
  1.3 国内外同类研究现状分析及存在的问题  20
  1.4 展望  20-22
第二章BPMV、TRSV、ToRSV 及大豆内源基因BD30K 质粒的制备及其多重检测技术的研究  22-34
  2.1 材料与设备  22-23
    2.1.1 大豆种子材料  22
    2.1.2 试验所用的仪器及试剂  22-23
  2.2 实验方法  23-28
    2.2.1 引物设计与合成  23
    2.2.2 大豆总RNA 的提取  23-24
    2.2.3 cDNA 的合成  24
    2.2.4 PCR 扩增及产物鉴定  24-25
    2.2.5 DNA 克隆  25-26
    2.2.6 重组质粒的提取和鉴定  26-27
    2.2.7 以4 种质粒为模板的PCR 检测  27-28
    2.2.8 内源基因的选择  28
  2.3 结果与分析  28-32
    2.3.1 带毒大豆种子的获得  28
    2.3.2 内源基因选择结果  28-29
    2.3.3 四种质粒的单一PCR 检测结果  29-31
    2.3.4 多重PCR 优化反应  31-32
  2.4 讨论  32-34
第三章多重RT-PCR 检测侵染大豆几种检疫性病毒及大豆内源基因的研究  34-44
  3.1 实验材料与仪器、试剂  34
  3.2 实验方法  34-37
    3.2.1 病毒接种  34
    3.2.2 双抗体夹心-酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)  34-35
    3.2.3 病毒RNA 的提取  35
    3.2.4 单一RT-PCR 反应  35-36
    3.2.5 多重RT-PCR 反应  36-37
    3.2.6 灵敏度试验  37
      1）DAS-ELISA 方法的灵敏度试验  37
      2）RT-PCR 的灵敏度试验  37
  3.3 结果与分析  37-43
    3.3.1 DAS-ELISA 检测  37
    3.3.2 单一RT-PCR 检测  37-38
    3.3.3 多重RT-PCR 检测  38-39
    3.3.4 单项RT-PCR 与多重RT-PCR 敏感性试验  39-42
    3.3.5 DAS-ELISA 方法的灵敏度检测  42
    3.3.6 RT-PCR 的灵敏度检测  42-43
  3.4 讨论  43-44
第四章单管实时荧光 RT-PCR 方法同时检测大豆种子中的菜豆荚斑驳病毒和烟草环斑病毒  44-54
  4.1 材料与设备  44
    4.1.1 实验材料  44
    4.1.2 实验仪器和试剂  44
  4.2 实验方法  44-46
    4.2.1 引物和探针的设计及合成  44-45
    4.2.2 BPMV 和TRSV 的单一实时荧光RT-PCR 检测  45
    4.2.3 BPMV 和TRSV 引物和探针的特异性实验  45
    4.2.4 BPMV 和TRSV 两种病毒的单管双重实时荧光RT-PCR 检测  45
    4.2.5 双重实时荧光PCR 特异性测试  45
    4.2.6 灵敏度对比实验  45-46
  4.3 结果与分析  46-52
    4.3.1 BPMV 和TRSV 引物及探针的特异性测试  46-48
    4.3.2 实时荧光PCR 灵敏度检测  48-52
  4.4 讨论  52-54
第五章结论与展望  54-55
  5.1 结论  54
  5.2 展望  54-55
参考文献  55-58
附录  58-63
  附录A：常用缩略语表  58-59
  附录B：常用生化试剂、分子生物学试剂及仪器  59-60
  附录C：主要试剂的配制  60-63
致谢  63

利用多重PCR一次检测侵染大豆的几种检疫性病毒及大豆内源基因的研究

内容摘要

全文目录

相似论文