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脂肪酶基因工程菌高密度培养及诱导产酶研究

作 者: 何晓云
导 师: 王飞
学 校: 南京林业大学
专 业: 林产化学加工工程
关键词: 脂肪酶 毕赤酵母 基因工程菌 高密度培养 诱导产酶
分类号: TQ925
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要


本论文优化了米根霉脂肪酶基因工程菌在摇瓶中的产酶条件,并将其在10L发酵罐中扩大培养,探讨了该菌的高密度培养诱导产酶条件,包括对脂肪酶基因工程菌的接种量和甲醇补料策略的研究,解决了产酶过程中蛋白降解的问题,并对已克隆的米根霉脂肪酶基因进行了定点突变研究。主要结果如下:1、在摇瓶培养中,脂肪酶基因工程菌在培养基初始pH6.0、甲醇添加量1%、诱导时间96 h、诱导温度为30℃产酶最佳。采用2%的玉米浆粉取代传统的酵母浸提物和蛋白胨作为氮源,结果显示最高酶活为295 U/mL,不但以廉价的玉米浆替代了昂贵的酵母浸物作为培养基,且酶活提高了20%。2、脂肪酶基因工程菌在10L发酵罐中的高密度培养研究表明:7.5%接种量,利于脂肪酶基因工程菌的生长和表达;以恒溶氧反馈调控和梯度流加相结合方式补加甘油,补加6h可达预期菌体密度,将菌体培养时间缩短了24 h;在线控制甲醇补料策略利于脂肪酶的表达,酶活提高为692 U/mL,蛋白浓度为1.6g/L,约为恒溶氧反馈调控补加甲醇方式酶活和蛋白浓度的2倍。3、探讨了在细胞高密度培养中减少脂肪酶降解的策略,包括对pH、添加不同的氮源及含量和诱导温度的研究。结果显示:在pH5.0、补加0.5%酪蛋白、诱导温度为22℃的条件下,经SDS-PAGE检测,重组脂肪酶的降解情况得到了明显改善。4、进行了10L发酵罐高密度培养条件优化研究,得到的优化条件为:7.5%接种量,生长温度为30℃,pH5.0,采用恒溶氧反馈调控和梯度流加方式补加甘油,诱导温度为22℃,添加0.5%酪蛋白水解物,甲醇的浓度为0.3%-0.5%。在此条件下,最终OD600为479,细胞湿重为419.0g/L,细胞干重为128.3g/L,蛋白浓度最终为3.0g/L,最高酶活为1302 U/mL,比摇瓶表达最高酶活提高约3.4倍。5、对米根霉脂肪酶基因进行了定点突变(SDM)研究,并将重组质粒转至毕赤酵母KM71H中表达,结果表明:在摇瓶中,脂肪酶酶活为244 U/mL,蛋白浓度为0.38 g/L;在发酵罐高密度培养条件下,脂肪酶酶活为503 U/mL,蛋白浓度为0.91g/L。

全文目录


致谢  3-4
摘要  4-5
Abstract  5-10
第一章 绪论  10-22
  1.1 脂肪酶的研究现状  10-15
    1.1.1 脂肪酶的来源  10-11
    1.1.2 脂肪酶的结构特征  11
    1.1.3 脂肪酶的理化性质  11-12
    1.1.4 脂肪酶的催化反应机制  12-13
    1.1.5 脂肪酶的活性测定  13-14
    1.1.6 脂肪酶基因的克隆表达  14
    1.1.7 脂肪酶的应用  14-15
  1.2 巴斯德毕赤酵母表达系统  15-16
    1.2.1 巴斯德毕赤酵母表达系统的简介  15
    1.2.2 巴斯德毕赤酵母表达系统的优点  15-16
  1.3 巴斯德毕赤酵母高密度培养的国内外研究进展  16-19
    1.3.1 高密度培养简介  16
    1.3.2 巴斯德毕赤酵母高密度培养过程控制  16-17
    1.3.3 巴斯德毕赤酵母高密度培养的补料分批培养策略  17-18
    1.3.4 防止蛋白降解策略  18-19
  1.4 脂肪酶高密度培养的研究现状  19-20
  1.5 本课题的研究意义及研究内容  20-22
第二章 重组脂肪酶高效表达的条件优化  22-33
  2.1 实验材料  22-25
    2.1.1 主要仪器  22-23
    2.1.2 实验菌种  23
    2.1.3 试验药品  23
    2.1.4 培养基与主要试剂的配制  23-25
  2.2 实验方法  25-28
    2.2.1 摇瓶试验水平上脂肪酶基因工程菌的诱导培养  25-26
    2.2.2 脂肪酶活性测定  26
    2.2.3 重组脂肪酶SDS-PAGE分析  26-28
  2.3 结果与讨论  28-32
    2.3.1 摇瓶培养中培养基初始pH对脂肪酶基因工程菌产酶的影响  28-29
    2.3.2 甲醇诱导浓度及诱导时间对脂肪酶基因工程菌产酶的影响  29-30
    2.3.3 诱导温度对脂肪酶基因工程菌产酶的影响  30-31
    2.3.4 氮源对脂肪酶基因工程菌产酶的影响  31
    2.3.5 重组脂肪酶SDS-PAGE分析结果  31-32
  2.4 本章小结  32-33
第三章 脂肪酶基因工程菌的高密度培养及诱导表达  33-47
  3.1 实验材料  33-35
    3.1.1 实验菌种  33
    3.1.2 试验药品  33
    3.1.3 培养基与主要试剂的配制  33-35
    3.1.4 主要仪器  35
  3.2 实验方法  35-39
    3.2.1 种子液制备  35-36
    3.2.2 上罐及高密度培养条件控制  36
    3.2.3 脂肪酶基因工程菌高密度培养条件探讨  36-37
    3.2.4 分析方法  37-39
  3.3 结果与讨论  39-46
    3.3.1 接种量的影响  39-41
    3.3.2 甘油补料方式对脂肪酶高密度培养的影响  41-43
    3.3.3 甲醇补料方式对脂肪酶基因工程菌高密度培养诱导产酶的影响  43-45
    3.3.4 重组脂肪酶SDS-PAGE分析结果  45-46
  3.4 本章小结  46-47
第四章 高密度培养时重组脂肪酶的降解及其解决策略研究  47-61
  4.1 实验材料  47-48
    4.1.1 菌种  47
    4.1.2 试验药品  47
    4.1.3 培养基与主要试剂的配制  47-48
    4.1.4 主要仪器  48
  4.2 实验方法  48-49
    4.2.1 不同pH条件下诱导  48
    4.2.2 添加玉米浆粉和酪蛋白  48
    4.2.3 低温诱导  48
    4.2.4 菌体生物量的测定  48
    4.2.5 脂肪酶酶活的测定  48
    4.2.6 总蛋白浓度分析  48
    4.2.7 重组脂肪酶SDS-PAGE分析  48-49
  4.3 结果与讨论  49-59
    4.3.1 pH对脂肪酶表达的影响  49-51
    4.3.2 培养基的组成对脂肪酶表达的影响  51-54
    4.3.3 诱导温度对脂肪酶表达的影响  54-57
    4.3.4 优化结果  57-59
  4.4 本章小结  59-61
第五章 脂肪酶突变体基因的构建及其在毕赤酵母中的表达  61-74
  5.1 实验材料  61-63
    5.1.1 菌种及质粒  61
    5.1.2 酶及主要药品  61
    5.1.3 培养基与主要试剂的配制  61-63
    5.1.4 主要仪器  63
  5.2 实验方法  63-69
    5.2.1 突变体ROL(K69R)基因的构建  63-67
    5.2.2 突变ROL(K69R)转化毕赤酵母  67-68
    5.2.3 突变重组毕赤酵母工程菌的诱导表达  68-69
    5.2.4 脂肪酶酶活的测定  69
    5.2.5 总蛋白浓度分析  69
    5.2.6 重组脂肪酶SDS-PAGE分析  69
  5.3 结果与讨论  69-73
    5.3.1 PCR扩增ROL(K69R)  69-70
    5.3.2 突变体ROL(K69R)基因测序结果及分析  70
    5.3.3 突变重组菌橄榄油-MMH-RB平板活性筛选  70
    5.3.4 突变重组菌在摇瓶中表达的结果  70-71
    5.3.5 突变重组菌10L发酵罐高密度培养的结果  71-72
    5.3.6 重组脂肪酶SDS-PAGE分析结果  72-73
  5.4 本章小结  73-74
结论  74-76
参考文献  76-83
详细摘要  83-84
Abstract  84

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 酶制剂(酵素)
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