学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示
脂肪酶基因工程菌高密度培养及诱导产酶研究
作 者: 何晓云
导 师: 王飞
学 校: 南京林业大学
专 业: 林产化学加工工程
关键词: 脂肪酶 毕赤酵母 基因工程菌 高密度培养 诱导产酶
分类号: TQ925
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
下 载: 51次
引 用: 0次
阅 读: 论文下载
内容摘要
本论文优化了米根霉脂肪酶基因工程菌在摇瓶中的产酶条件,并将其在10L发酵罐中扩大培养,探讨了该菌的高密度培养及诱导产酶条件,包括对脂肪酶基因工程菌的接种量和甲醇补料策略的研究,解决了产酶过程中蛋白降解的问题,并对已克隆的米根霉脂肪酶基因进行了定点突变研究。主要结果如下:1、在摇瓶培养中,脂肪酶基因工程菌在培养基初始pH6.0、甲醇添加量1%、诱导时间96 h、诱导温度为30℃产酶最佳。采用2%的玉米浆粉取代传统的酵母浸提物和蛋白胨作为氮源,结果显示最高酶活为295 U/mL,不但以廉价的玉米浆替代了昂贵的酵母浸物作为培养基,且酶活提高了20%。2、脂肪酶基因工程菌在10L发酵罐中的高密度培养研究表明:7.5%接种量,利于脂肪酶基因工程菌的生长和表达;以恒溶氧反馈调控和梯度流加相结合方式补加甘油,补加6h可达预期菌体密度,将菌体培养时间缩短了24 h;在线控制甲醇补料策略利于脂肪酶的表达,酶活提高为692 U/mL,蛋白浓度为1.6g/L,约为恒溶氧反馈调控补加甲醇方式酶活和蛋白浓度的2倍。3、探讨了在细胞高密度培养中减少脂肪酶降解的策略,包括对pH、添加不同的氮源及含量和诱导温度的研究。结果显示:在pH5.0、补加0.5%酪蛋白、诱导温度为22℃的条件下,经SDS-PAGE检测,重组脂肪酶的降解情况得到了明显改善。4、进行了10L发酵罐高密度培养条件优化研究,得到的优化条件为:7.5%接种量,生长温度为30℃,pH5.0,采用恒溶氧反馈调控和梯度流加方式补加甘油,诱导温度为22℃,添加0.5%酪蛋白水解物,甲醇的浓度为0.3%-0.5%。在此条件下,最终OD600为479,细胞湿重为419.0g/L,细胞干重为128.3g/L,蛋白浓度最终为3.0g/L,最高酶活为1302 U/mL,比摇瓶表达最高酶活提高约3.4倍。5、对米根霉脂肪酶基因进行了定点突变(SDM)研究,并将重组质粒转至毕赤酵母KM71H中表达,结果表明:在摇瓶中,脂肪酶酶活为244 U/mL,蛋白浓度为0.38 g/L;在发酵罐高密度培养条件下,脂肪酶酶活为503 U/mL,蛋白浓度为0.91g/L。
|
全文目录
致谢 3-4 摘要 4-5 Abstract 5-10 第一章 绪论 10-22 1.1 脂肪酶的研究现状 10-15 1.1.1 脂肪酶的来源 10-11 1.1.2 脂肪酶的结构特征 11 1.1.3 脂肪酶的理化性质 11-12 1.1.4 脂肪酶的催化反应机制 12-13 1.1.5 脂肪酶的活性测定 13-14 1.1.6 脂肪酶基因的克隆表达 14 1.1.7 脂肪酶的应用 14-15 1.2 巴斯德毕赤酵母表达系统 15-16 1.2.1 巴斯德毕赤酵母表达系统的简介 15 1.2.2 巴斯德毕赤酵母表达系统的优点 15-16 1.3 巴斯德毕赤酵母高密度培养的国内外研究进展 16-19 1.3.1 高密度培养简介 16 1.3.2 巴斯德毕赤酵母高密度培养过程控制 16-17 1.3.3 巴斯德毕赤酵母高密度培养的补料分批培养策略 17-18 1.3.4 防止蛋白降解策略 18-19 1.4 脂肪酶高密度培养的研究现状 19-20 1.5 本课题的研究意义及研究内容 20-22 第二章 重组脂肪酶高效表达的条件优化 22-33 2.1 实验材料 22-25 2.1.1 主要仪器 22-23 2.1.2 实验菌种 23 2.1.3 试验药品 23 2.1.4 培养基与主要试剂的配制 23-25 2.2 实验方法 25-28 2.2.1 摇瓶试验水平上脂肪酶基因工程菌的诱导培养 25-26 2.2.2 脂肪酶活性测定 26 2.2.3 重组脂肪酶SDS-PAGE分析 26-28 2.3 结果与讨论 28-32 2.3.1 摇瓶培养中培养基初始pH对脂肪酶基因工程菌产酶的影响 28-29 2.3.2 甲醇诱导浓度及诱导时间对脂肪酶基因工程菌产酶的影响 29-30 2.3.3 诱导温度对脂肪酶基因工程菌产酶的影响 30-31 2.3.4 氮源对脂肪酶基因工程菌产酶的影响 31 2.3.5 重组脂肪酶SDS-PAGE分析结果 31-32 2.4 本章小结 32-33 第三章 脂肪酶基因工程菌的高密度培养及诱导表达 33-47 3.1 实验材料 33-35 3.1.1 实验菌种 33 3.1.2 试验药品 33 3.1.3 培养基与主要试剂的配制 33-35 3.1.4 主要仪器 35 3.2 实验方法 35-39 3.2.1 种子液制备 35-36 3.2.2 上罐及高密度培养条件控制 36 3.2.3 脂肪酶基因工程菌高密度培养条件探讨 36-37 3.2.4 分析方法 37-39 3.3 结果与讨论 39-46 3.3.1 接种量的影响 39-41 3.3.2 甘油补料方式对脂肪酶高密度培养的影响 41-43 3.3.3 甲醇补料方式对脂肪酶基因工程菌高密度培养诱导产酶的影响 43-45 3.3.4 重组脂肪酶SDS-PAGE分析结果 45-46 3.4 本章小结 46-47 第四章 高密度培养时重组脂肪酶的降解及其解决策略研究 47-61 4.1 实验材料 47-48 4.1.1 菌种 47 4.1.2 试验药品 47 4.1.3 培养基与主要试剂的配制 47-48 4.1.4 主要仪器 48 4.2 实验方法 48-49 4.2.1 不同pH条件下诱导 48 4.2.2 添加玉米浆粉和酪蛋白 48 4.2.3 低温诱导 48 4.2.4 菌体生物量的测定 48 4.2.5 脂肪酶酶活的测定 48 4.2.6 总蛋白浓度分析 48 4.2.7 重组脂肪酶SDS-PAGE分析 48-49 4.3 结果与讨论 49-59 4.3.1 pH对脂肪酶表达的影响 49-51 4.3.2 培养基的组成对脂肪酶表达的影响 51-54 4.3.3 诱导温度对脂肪酶表达的影响 54-57 4.3.4 优化结果 57-59 4.4 本章小结 59-61 第五章 脂肪酶突变体基因的构建及其在毕赤酵母中的表达 61-74 5.1 实验材料 61-63 5.1.1 菌种及质粒 61 5.1.2 酶及主要药品 61 5.1.3 培养基与主要试剂的配制 61-63 5.1.4 主要仪器 63 5.2 实验方法 63-69 5.2.1 突变体ROL(K69R)基因的构建 63-67 5.2.2 突变ROL(K69R)转化毕赤酵母 67-68 5.2.3 突变重组毕赤酵母工程菌的诱导表达 68-69 5.2.4 脂肪酶酶活的测定 69 5.2.5 总蛋白浓度分析 69 5.2.6 重组脂肪酶SDS-PAGE分析 69 5.3 结果与讨论 69-73 5.3.1 PCR扩增ROL(K69R) 69-70 5.3.2 突变体ROL(K69R)基因测序结果及分析 70 5.3.3 突变重组菌橄榄油-MMH-RB平板活性筛选 70 5.3.4 突变重组菌在摇瓶中表达的结果 70-71 5.3.5 突变重组菌10L发酵罐高密度培养的结果 71-72 5.3.6 重组脂肪酶SDS-PAGE分析结果 72-73 5.4 本章小结 73-74 结论 74-76 参考文献 76-83 详细摘要 83-84 Abstract 84
|
相似论文
- 扩展青霉TS414脂肪酶在毕赤酵母的表达、纯化及其催化外消旋萘普生酯化拆分的研究,Q814
- 米曲霉FS-1脂肪酶发酵优化、分离纯化与酶学特性的研究,TQ925.6
- 易错PCR定向进化扩展青霉FS1884脂肪酶,Q78
- Pseudomonas sp.RT-1低温脂肪酶发酵条件优化、纯化及基因的克隆表达,TQ925
- 杏鲍菇(Pleurotus eryngii)漆酶基因的体外诱变及在毕赤酵母中表达,TQ925
- 液芯胶囊制备特性研究及在牛奶连续接种中的应用,TS252.4
- 阿特拉津降解菌生物学特性的研究,关键降解酶基因克隆及基因簇的构建,X172
- 腐生葡萄球菌M36耐有机溶剂脂肪酶基因的克隆与表达,Q78
- Aspergillus niger Z-25葡萄糖氧化酶基因在毕赤酵母中的表达,Q78
- 香菇漆酶基因在毕赤酵母中的表达及对三苯甲烷类染料脱色的研究,TQ925
- 脂肪酶催化猪油合成L-抗坏血酸脂肪酸酯,TS221
- 洋葱假单胞菌S31脂肪酶的分离提取及其在食品中应用,TS201.25
- 芽孢杆菌yczE基因生防功能分析及表达Harpin蛋白的工程菌防病效果研究,S476.1
- 拮抗酵母菌抑菌机理及对草莓采后冷藏品质影响的研究,S668.4
- 3-苯氧基苯甲酸降解菌Sphingobium sp. BA3的分离鉴定、生物学特性及基因工程菌的构建,X172
- 根霉中β-葡萄糖苷酶基因克隆及表达,Q78
- EL antisense抗动脉粥样硬化的研究,R543.5
- 凝血因子Ⅷ在毕赤酵母中的表达,R554.1
- 转萝卜过氧化物酶基因RsPrx1酵母表达条件优化及其抗性机理研究,Q943.2
- 不同来源的谷胱甘肽合成酶对重组毕赤酵母合成谷胱甘肽的影响研究,TQ936.16
- 腐乳发酵过程中脂肪水解变化的研究,TS214.2
中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 酶制剂(酵素)
© 2012 www.xueweilunwen.com
|