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重组HIV-1 Vif 158的表达、复性与纯化研究

作　者: 李国庆
导　师: 白泉
学　校: 西北大学
专　业: 化学生物学
关键词: 蛋白折叠液相色谱(P FLC) 人免疫缺陷病毒1型感染因子1 58(H IV-1Vifl58) 包涵体色谱饼复性纯化
分类号: R373
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

蛋白折叠液相色谱(PFLC)在重组蛋白的包涵体复性过程中具有除变性剂、纯化、复性、回收变性剂的四重作用,已被广泛地应用于蛋白复性与纯化研究。本论文①对大肠杆菌(E.coli)表达的重组人免疫缺陷病毒1型感染因子158(recombinant human immunodeficiency virus type one virion infectivity factor 158, rHIV-1 Vif 158)进行了摇瓶中培养条件的优化,获得了高表达的rHIV-1 Vif 158包涵体；②经超声破碎,洗涤获得包涵体蛋白,对包涵体蛋白的溶解条件进行了比较,获得了rHIV-1 Vif 158包涵体的抽提液；③应用PFLC对rHIV-1 Vif 158包涵体复性与纯化进行研究,为研究HIV-1 Vif 158结构和功能奠定了基础。本文分为四部分：1.文献综述：介绍了HIV-1 Vif蛋白结构和功能的研究进展及研究HIV-1Vif158的意义；简述了蛋白复性的意义和PFLC在蛋白复性与纯化的原理和应用。2. rHIV-1 Vif 158在E.coli表达及包涵体溶解条件的优化：研究了摇瓶中的培养基、温度、诱导时间对rHIV-1 Vif 158表达量的影响及包涵体溶解液对rHIV-1 Vif 158包涵体溶解度的影响。实验结果表明,在M9培养基,温度为35℃、诱导4 h时rHIV-1 Vif 158表达量占菌体总蛋白的33.1%,确定低浓度的脲和去垢剂结合溶解rHIV-1 Vif 158包涵体,可以取得较好的溶解效果,5 mol/L脲和1%的SLS溶解效果最好。3.高效疏水色谱对rHIV-1 Vif 158包涵体复性与纯化：研究了利用疏水色谱饼对不同包涵体抽提液、流动相脲浓度、流动相的pH值、色谱梯度条件和进样量等因素对rHIV-1 Vif 158包涵体的复性并同时纯化的影响,在优化条件下质量回收率为48.6%,纯度为91.3%。4.排阻色谱对rHIV-1 Vif 158包涵体复性与纯化：考察了排阻色谱中的脲浓度,脲梯度SEC的流速对复性与同时的纯化rHIV-1 Vif 158影响,在排阻色谱和脲梯度排阻色谱下复性与纯化rHIV-1 Vif 158包涵体的质量回收率为42.7%和55.3%,纯度分别为86.4%和89.3%。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-9
第一章文献综述  9-26
  1.1 前言  9
  1.2 HIV-1 Vif蛋白  9-12
    1.2.1 HIV-1 Vif蛋白的结构  10-11
    1.2.2 HIV-1 Vif蛋白的生物学功能  11
    1.2.3 HIV-1 Vif 158蛋白  11-12
  1.3 重组蛋白  12-13
  1.4 重组蛋白的变性  13
  1.5 重组蛋白复性技术  13-17
    1.5.1 蛋白质复性方法  13-14
    1.5.2 蛋白折叠液相色谱法  14-17
    1.5.3 重组HIV-1 Vif蛋白的复性与纯化  17
  1.6 本实验的研究思路和工作  17-18
  参考文献  18-26
第二章 rHIV-1 Vif 158表达及包涵体溶解条件的优化  26-38
  2.1 引言  26-27
  2.2 仪器试剂  27-29
  2.3 实验方法  29-31
    2.3.1 发酵试剂的配制  29
    2.3.2 Bradford法测定蛋白含量  29
    2.3.3 SDS-PAGE凝胶电泳的操作  29
    2.3.4 菌种的培养  29-30
    2.3.5 rHIV-1 Vif 158包涵体溶解  30-31
  2.4 结果的测定  31
  2.5 摇瓶中rHIV-1 Vif 158发酵条件的优化  31-34
    2.5.1 培养基种类对rHIV-1 Vif 158菌体生长、表达的影响  31-32
    2.5.2 温度对rHIV-1 Vif 158菌体生长、表达的影响  32
    2.5.3 诱导表达时间对rHIV-1 Vif 158菌体生长、表达的影响  32-33
    2.5.4 优化条件下rHIV-1 Vif 158菌体的生长和表达情况  33-34
  2.6 不同包涵体溶解液对rHIV-1 Vif 158包涵体溶解的影响  34-36
    2.6.1 高浓度变性剂对rHIV-1 Vif 158包涵体溶解  34
    2.6.2 去垢剂和变性剂结合对rHIV-1 Vif 158包涵体溶解  34-35
    2.6.3 五种包涵体溶解液对rHIV-1 Vif 158包涵体溶解的影响  35-36
  2.7 本章小结  36
  参考文献  36-38
第三章高效疏水色谱对rHIV-1 Vif 158包涵体复性与纯化  38-51
  3.1 引言  38-39
  3.2 实验部分  39-41
    3.2.1 仪器  39-40
    3.2.2 实验试剂  40
    3.2.3 Bradford法测定蛋白含量  40
    3.2.4 SDS-PAGE凝胶电泳操作  40
    3.2.5 高效疏水色谱对rHIV-1 Vif 158的复性与纯化条件  40-41
    3.2.6 电泳样品处理  41
  3.3 结果与讨论  41-49
    3.3.1 不同抽提液对rHIV-1 Vif 158复性与纯化的影响  41-42
    3.3.2 流动相中含有不同脲浓度的对rHIV-1 Vif158复性与纯化的影响  42-44
    3.3.3 梯度条件的对rHIV-1 Vif 158复性与纯化的影响  44-45
    3.3.4 流动相pH值对rHIV-1 Vif 158复性与纯化的影响  45-46
    3.3.5 进样量对rHIV-1 Vif 158复性与纯化的影响  46-47
    3.3.6 在最优条件下疏水色谱对rHIV-1 Vif 158的复性与纯化  47-49
  3.4 本章小结  49
  参考文献  49-51
第四章体积排阻色谱对rHIV-1 Vif 158包涵体复性与纯化  51-58
  4.1 引言  51-52
  4.2 实验部分  52-53
    4.2.1 仪器和试剂  52
    4.2.3 Bradford法测定蛋白含量  52
    4.2.4 SDS-PAGE凝胶电泳操作  52
    4.2.5 电泳样品处理  52
    4.2.6 体积排阻色谱对rHIV-1 Vif 158的复性与纯化条件  52-53
  4.3 结果和讨论  53-56
    4.3.1 流动相中含有不同脲浓度对rHIV-1 Vif 158复性与纯化的影响  53-54
    4.3.2 脲梯度在不同流速下对rHIV-1 Vif 158复性与纯化的影响  54-56
  4.4 本章小结  56
  参考文献  56-58
论文结论  58-59
攻读硕士期间发表的论文  59-60
致谢  60

重组HIV-1 Vif 158的表达、复性与纯化研究

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