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重组萤火虫荧光素酶及其稳定性研究

作　者: 刘艳杰
导　师: 黄鹤
学　校: 天津大学
专　业: 生物分子工程
关键词: 荧光素酶基因克隆原核表达稳定性
分类号: Q814
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

荧光素酶是由一条多肽链组成的高效生物催化剂。在ATP、Mg2+、O2等适宜的条件下,能够以荧光素为底物发生催化反应并发出荧光。鉴于上述特点,荧光素酶在诸多领域有着重要的应用,本文旨在实现重组萤火虫荧光素酶的国产化规模生产并对其稳定性进行研究。本课题首先通过PCR扩增技术获得荧光素酶基因,然后利用DNA重组技术将荧光素酶基因连接到表达载体pET28a中。经过酶切和测序鉴定获得重组荧光素酶的高效表达载体。然后采用低温条件,经1mmol的IPTG诱导后发酵出了具有高活性的荧光素酶,同时也对诱导表达条件进行了优化。其最佳诱导条件是:诱导温度22℃,诱导时的菌密度即OD 0.6,诱导时间18小时,诱导剂IPTG浓度是1mmol/L。在此基础上,本研究尝试了将发酵放大到了中试规模,然后收集湿菌并利用超声波进行低温破菌,离心并收集破菌上清。通过ATP快速检测装置检测到了上清液中含有高活性的荧光素酶。利用离子交换层析和亲和层析对荧光素酶进行分离纯化,最终4g湿菌分离纯化出了50ml荧光素酶,利用Braford法测得其浓度为2.5mg/ml。上述方法和国内外同行相比并没有应用包涵体复性的生产工艺,但是提高了荧光素酶的收率,而且还节约了生产成本。继而,本论文对影响荧光素酶催化发光的各因素做出深入探讨,在此基础上对荧光素酶的稳定性做系统研究并开发出几种性价比适宜的配伍保护剂。在荧光素酶的稳定性显著提高的基础上,本实验对荧光素酶在微生物安全快速检测的应用方面做了尝试性的研究,先后设计了检测试子和细菌裂解液,以满足快检装置的试剂配套需求。

全文目录

摘要  3-4
ABSTRACT  4-7
前言  7-8
第一章文献综述  8-21
  1.1 萤火虫及荧光素酶的简介  8-10
    1.1.1 萤火虫的生物学特性  8
    1.1.2 荧光素酶的基本特性  8-9
    1.1.3 荧光素酶的研究历史  9-10
  1.2 萤火虫发光原理和荧光素酶的稳定性  10-13
    1.2.1 萤火虫的发光原理  11
    1.2.2 荧光素酶的稳定性  11-13
  1.3 荧光素酶的应用及研究现状  13-15
    1.3.1 荧光素酶的应用  14-15
    1.3.2 国内外研究现状及应用前景  15
  1.4 基因工程重组蛋白在大肠杆菌中的表达  15-16
    1.4.1 表达载体的选择  16
    1.4.2 pET28a 的表达系统  16
  1.5 蛋白质的分离纯化  16-20
    1.5.1 亲和层析  17-19
    1.5.2 离子交换层析  19-20
  1.6 本文研究的主要内容  20-21
第二章重组荧光素酶高效表达载体的构建及诱导表达  21-41
  2.1 实验材料  21-23
    2.1.1 菌种和载体  21-22
    2.1.2 实验试剂  22-23
    2.1.3 实验仪器  23
  2.2 实验方法  23-29
    2.2.1 引物的设计与合成  23-24
    2.2.2 目的基因的获取  24-25
    2.2.3 重组载体pET28a-Luc 构建  25-29
    2.2.4 重组子阳性克隆的筛选和鉴定  29
  2.3 荧光素酶的诱导表达  29-31
    2.3.1 基因工程菌生长曲线的测定  29
    2.3.2 荧光素酶的诱导表达  29-30
    2.3.3 表达产物的SDS—PAGE 电泳鉴定  30-31
  2.4 荧光素酶诱导表达条件的优化  31-32
    2.4.1 诱导时机对荧光素酶产量的影响  31
    2.4.2 诱导温度对目的蛋白产量的影响  31
    2.4.3 诱导剂IPTG 浓度对目的蛋白产量的影响  31-32
    2.4.4 诱导时间的长短对荧光素酶产量的影响  32
  2.5 结果与讨论  32-41
    2.5.1 pET28a—luc 重组载体的构建  32-36
    2.5.2 荧光素酶的诱导表达  36-37
    2.5.3 荧光素酶表达条件的优化  37-41
第三章重组荧光素酶的分离纯化  41-51
  3.1 实验仪器与材料  41-42
    3.1.1 实验仪器  41-42
    3.1.2 实验材料  42
  3.2 基因工程菌的传代培养  42-43
  3.3 基因工程菌在发酵罐中发酵  43
  3.4 基因工程菌的超声波破碎和上清的收集  43-44
  3.5 光素酶的分离纯化  44-47
    3.5.1 菌上清的酶活检测  44
    3.5.2 阴离子交换法对目标蛋白的初步纯化  44-45
    3.5.3 应用亲和层析对荧光素酶的再次纯化  45
    3.5.4 透析除盐  45-46
    3.5.5 对纯化后的荧光素酶进行收率测定  46-47
  3.6 结果与讨论  47-51
第四章重组荧光素酶的稳定性研究及保护剂的开发  51-60
  4.1 实验仪器和材料  51
  4.2 荧光素酶催化发光的基本性质研究  51-52
    4.2.1 ATP 标准曲线的制作和仪器检测极限的确定  51-52
    4.2.2 不同荧光素的浓度对发光强度的影响  52
    4.2.3 不同M92+浓度对发光强度的影响  52
  4.3 荧光素酶稳定性的研究  52-53
    4.3.1 温度对荧光素酶活性的影响  53
    4.3.2 PH 对荧光素酶活性的影响  53
  4.4 几种保护剂对荧光素酶活性的保护作用的研究  53-54
    4.4.1 甘油对荧光素酶活性的保护作用  53
    4.4.2 蔗糖对荧光素酶活性的保护作用  53
    4.4.3 几种巯基保护剂对荧光素酶活性的保护作用  53-54
    4.4.4 BSA 对荧光素酶活性的保护作用  54
  4.5 结果与讨论  54-60
第五章重组荧光素的酶产品应用  60-63
  5.1 荧光素酶应用于食品药品等病原微生物含量的快速检测  60
  5.2 快速检测装置的设计  60-62
  5.3 破菌液的研究  62-63
第六章结论与展望  63-65
  6.1 结论  63-64
  6.2 展望  64-65
参考文献  65-67
致谢  67

重组萤火虫荧光素酶及其稳定性研究

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