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棉花GhWRKY3基因的分离及其表达特性分析

作　者: 郭若玉
导　师: 曹学成
学　校: 山东农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 棉花(Gossypium hirsutum L.) GhWRKY3 分子克隆信号分子表达分析转基因烟草
分类号: S562
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

WRKY是一类主要存在于植物中的转录因子超家族。自Ishiguro和Nakamura从甘薯中分离到SPF1后,WRKY便开始得到广泛的研究和关注,目前已经从多种植物中分离出了WRKY基因并鉴定了其功能。许多研究表明,WRKY参与了植物体的多种生物学过程,尤其是在植物的抗病反应中发挥了重要的作用。本研究以陆地棉为材料,从中克隆得到一个新WRKY基因即GhWRKY3,并对其进行了表达特性分析及初步的功能鉴定。具体结果如下:1、根据同源蛋白设计简并引物,用RACE和RT-PCR的方法从陆地棉中克隆得到一个新的WRKY基因,即GhWRKY3,GenBank注册号为FJ966887。GhWRKY3全长1,705bp,包含72bp的5′非编码区和109bp的3′非编码区,其开放阅读框共1,524bp,编码了一个含有507个氨基酸的多肽。序列分析发现该基因编码的蛋白含有两个典型的WRKY结构域和两个锌指结构(C-X₄-C-X_22–23-H-X₁-H),并且含有一个核定位信号序列PKRR,属于WRKY转录因子家族第I类成员。亚细胞定位发现,该蛋白位于细胞核内。GhWRKY3的基因组含有3个内含子和4个外显子,并且它的第3个内含子位于羧基端的WRKY结构域内。2、用反向PCR和巢式PCR的方法扩增出了该基因的部分启动子序列,共720bp,用PlantCARE在线软件分析发现,该启动子序列内除含有典型的TATA-box,CAAT-box外,还含有ABA应答元件,胁迫应答元件,光应答元件和胚乳发育相关元件等。根据这些结果推测,GhWRKY3可能在植物的胁迫应答反应中和生长发育过程中发挥了一定的作用。3、半定量RT-PCR分析显示,GhWRKY3在根茎叶中均有表达,不具有组织特异性。GhWRKY3可以被多种信号分子包括水杨酸（SA）、脱落酸（ABA）、茉莉酸甲酯（MeJA）、乙烯（ET）、赤霉素（GA₃）和过氧化氢（H₂O₂）所诱导,而在外源细胞分裂素6-BA,生长素类似物NAA的胁迫下,其表达量没有明显的变化。此外,GhWRKY3在真菌棉花枯萎病菌F. oxysporum f. sp. Vasinfectum、立枯丝核菌R. solani、炭疽菌C. gossypii和伤胁迫下表达量上升,而干旱（15%PEG6000）、高盐（NaCl）和低温（4℃）, GhWRKY3的表达量没有发生明显的变化。根据这些结果,可以推测GhWRKY3可能在植物的抗病反应和生长发育中发挥了一定的作用。4、构建了GhWRKY3正义植物表达载体pBI121-GhWRKY3,采用农杆菌介导的方法,转化本生烟草, PCR和RT-PCR鉴定分析表明GhWRKY3在烟草中成功表达。5、选取部分T0代转基因植株的自交种子扩增繁殖,得到T₁代转基因植株,在分子鉴定的基础上,初步证明所选择的株系的T₁代转基因植株种外源基因基本符合3:1的遗传分离定律。选取两株具有代表性的转基因植物的T₁代种子,对种子萌发和萌发早期幼苗的生长情况进行了初步分析,结果显示转基因植株比野生型植株萌发晚。进一步分析了转基因植株在添加不同浓度ABA或GA₃的培养基上的萌发和萌发早期幼苗生长情况,结果表明GhWRKY3可能参与调节ABA和GA介导的植物的生长发育过程。

全文目录

摘要  9-11
Abstract  11-13
1 引言  13-27
  1.1 病原相关分子模式激发的免疫反应（PTI）  13-14
  1.2 效应蛋白激发的免疫反应（ETI）  14-15
  1.3 植物激素与植物抗病反应  15-18
    1.3.1 水杨酸、茉莉酸与乙烯  15-16
    1.3.2 脱落酸  16-17
    1.3.3 其它一些与抗病相关的激素  17-18
  1.4 转录因子  18-25
    1.4.1 WRKY 转录因子的发现及其起源  18-19
    1.4.2 WRKY 转录因子的结构特点  19-21
    1.4.3 WRKY 转录因子的结合序列  21-22
    1.4.4 WRKY 转录因子的分类  22
    1.4.5 WRKY 转录因子的生物学功能  22-25
  1.5 本研究的目的和意义  25-27
2 材料与方法  27-51
  2.1 实验材料  27-29
    2.1.1 植物材料  27
    2.1.2 植物材料培养与处理  27-28
    2.1.3 菌株与质粒  28
    2.1.4 酶与各种生化试剂  28
    2.1.5 PCR 引物  28-29
  2.2 实验方法  29-51
    2.2.1 RNA 提取  29-31
    2.2.2 cDNA 第一链的合成  31-32
    2.2.3 cDNA 回收纯化与加尾  32
    2.2.4 cDNA 全长序列的获得  32-35
    2.2.5 植物总DNA 的提取与纯化  35-37
    2.2.6 基因组DNA 的获得和启动子的分离  37-38
    2.2.7 目的片段的回收  38-39
    2.2.8 目的片段与克隆载体的连接  39
    2.2.9 大肠杆菌感受态细胞制备  39
    2.2.10 大肠杆菌感受态细胞的转化  39-40
    2.2.11 质粒DNA 的提取  40-42
    2.2.12 对重组质粒的鉴定  42-43
    2.2.13 半定量RT-PCR 检测目的基因的表达  43-44
    2.2.14 植物表达载体的构建与转化  44-48
    2.2.15 农杆菌介导转化烟草  48-49
    2.2.16 转基因植物的鉴定  49
    2.2.17 主要的序列分析软件  49-51
3 结果与分析  51-72
  3.1 棉花GhWRKY3 基因的克隆  51-53
    3.1.1 棉花RNA 的提取及反转录  51
    3.1.2 GhWRKY3 中间片段的分离  51-52
    3.1.3 GhWRKY3 5′片段的分离  52
    3.1.4 GhWRKY3 3′片段的分离  52
    3.1.5 GhWRKY3 全长cDNA 的分离  52-53
  3.2 GhWRKY3 的序列分析  53-60
    3.2.1 GhWRKY3 的全长cDNA 序列分析  53-55
    3.2.2 GhWRKY3 编码蛋白序列分析  55-58
    3.2.3 GhWRKY3 基因组序列分析  58-60
  3.3 GhWRKY3 的亚细胞定位分析  60-62
  3.4 GhWRKY3 的表达特性分析  62-65
    3.4.1 GhWRKY3 在棉花不同的组织器官中的表达特性  62
    3.4.2 GhWRKY3 在信号分子的诱导下表达特性分析  62-64
    3.4.3 GhWRKY3 在非生物胁迫下的表达特性分析  64
    3.4.4 GhWRKY3 在生物胁迫下的表达特性分析  64-65
  3.5 GhWRKY3 在烟草中的超表达及功能初探  65-72
    3.5.1 转基因正义表达载体的构建  65
    3.5.2 转基因植株的获得  65-66
    3.5.3 转基因植株的PCR 鉴定  66-67
    3.5.4 转基因植株的半定量RT-PCR 分析  67
    3.5.5 T_1 代转基因植株的PCR 鉴定  67-68
    3.5.6 T_1 代转基因植株的萌发和萌发后早期的生长情况  68-72
4 讨论  72-76
  4.1 GhWRKY3 蛋白结构特征.  72
  4.2 GhWRKY3 基因启动子序列分析  72
  4.3 GhWRKY3 在外界环境胁迫下的表达特性分析  72-74
  4.4 GhWRKY3 在转基因烟草生长发育过程中的作用初探  74-76
5 结论  76-77
参考文献  77-87
附录  87-89
致谢  89-90
攻读学位期间发表的学术论文  90

棉花GhWRKY3基因的分离及其表达特性分析

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