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山羊关节炎脑炎病毒分子检测技术研究

作　者: 孙跃辉
导　师: 黄金海
学　校: 天津大学
专　业: 食品科学
关键词: 山羊关节炎脑炎病毒 基因组 环介导等温扩增技术 P25蛋白 免疫印迹 酶联免疫吸附试验
分类号: S858.27
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


由山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)引发的山羊关节炎脑炎(CAE)是世界养羊业中破坏力最强、经济学意义最重要的病毒性传染病。本研究对CAEV89-GB1026株进行了全基因组克隆和序列测定,分析了CAEV的分子特性;应用环介导等温扩增技术,建立了CAEV快速检测方法;同时通过构建衣壳蛋白P25的原核表达载体,获得高纯度的重组表达蛋白,初步建立了CAEV感染羊抗体监测的ELISA方法。采用PCR的方法,扩增出覆盖CAEV全基因组的5个cDNA片段,分别将其克隆到pGEM-T easy载体,经序列测定、拼接获得了CAEV89-GB1026株的全基因组序列。该毒株基因组全长9065nt,包括一段453nt的5’LTR、3个结构基因(gag、pol和env)、2个调节蛋白编码基因(rev和tat)、1个辅助蛋白编码基因(vif)和一段308nt的3’LTR。序列比较结果显示,该毒株与甘肃分离株相似性为99.6%,与意大利分离毒株的相似性仅为73.0%~73.5%。依据gag基因对国内外分离株同源关系分析表明,该毒株属于小反刍动物慢病毒B亚群B2亚型,Gag蛋白中存在多个与MVV相同的抗原表位。在p25基因的高保守区设计了5条引物,应用LAMP扩增技术建立了CAEV快速检测方法。采用LAMP实时浊度仪对扩增反应进行检测,可在36min内检测数个拷贝的质粒,灵敏度相当常规PCR的100倍。分别应用琼脂糖凝胶扩散实验(AGID)、常规PCR和LAMP对68份临床样品进行了检测,阳性率分别为38.2%, 41.2%和50%。该方法可用于细胞培养物、感病动物全血和外周血淋巴细胞中CAEV原病毒DNA的特异性检测。应用生物信息学方法对衣壳蛋白P25和P25融合蛋白的生化特性进行分析,设计了不同的原核表达载体。将p25基因克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,在E.coli BL21细胞中可溶性表达,经GST亲和层析获得重组蛋白GST-P25。将p25基因克隆至原核表达载体pET28a,将重组质粒转化E.coli BL21(DE3)诱导表达,通过包涵体变性、复性的方法获得重组蛋白His-P25。应用免疫印迹两种重组蛋白的抗原性进行分析,重组蛋白可与CAEV阳性血清特异性地结合,表明重组蛋白具有良好的抗原性,并以His-P25为抗原,建立了检测CAEV抗体的间接ELISA。

全文目录


中文摘要  3-4
ABSTRACT  4-10
第一章 文献综述：山羊关节炎脑炎病毒研究进展  10-31
  1.1 历史与现状  10-11
  1.2 病原学  11-18
    1.2.1 分类地位和形态学特征  11
    1.2.2 理化与生物学特征  11-12
    1.2.3 病毒的生物学周期  12-13
    1.2.4 CAEV 的分子生物学特征  13-18
  1.3 流行病学特点  18-20
    1.3.1 易感动物  18-19
    1.3.2 传播途径  19
    1.3.3 流行特点及其影响因素  19
    1.3.4 流行情况  19-20
  1.4 致病性  20-22
    1.4.1 临床症状  20-21
    1.4.2 组织病理变化  21
    1.4.3 致病机理  21-22
  1.5 免疫特性  22-24
  1.6 诊断  24-28
    1.6.1 初步诊断  24-25
    1.6.2 病毒的分离与鉴定  25
    1.6.3 病原的检测技术研究进展  25-26
    1.6.4 抗体检测技术研究进展  26-28
    1.6.5 鉴别诊断  28
  1.7 防治  28-29
    1.7.1 加强引种管理  28
    1.7.2 加强饲养管理  28-29
  1.8 公共卫生学意义  29-30
    1.8.1 CAEV 与食品安全  29
    1.8.2 CAEV 与HIV  29-30
  1.9 存在的问题  30
  1.10 研究的目的与意义  30-31
第二章 CAEV89-GB1026 株全基因组序列测定与分子特性分析  31-65
  2.1 实验材料  31-35
    2.1.1 毒株  31
    2.1.2 载体与菌株  31
    2.1.3 主要试剂  31
    2.1.4 细胞培养所用溶液及其配制  31-32
    2.1.5 DNA 提取用试剂及配制  32-33
    2.1.6 大肠杆菌感受态细胞制备及转化、诱导用溶液  33
    2.1.7 质粒DNA 小量提取用溶液  33-34
    2.1.8 琼脂糖凝胶电泳所用溶液  34
    2.1.9 分析用序列  34-35
  2.2 方法  35-40
    2.2.1 胎山羊滑膜（GSM）细胞的培养及传代  35-36
    2.2.2 CAEV 的增殖  36
    2.2.3 CAEV 感染的GSM 细胞中总DNA 的提取  36
    2.2.4 引物设计  36-37
    2.2.5 CAEV 全基因组片段的PCR 扩增  37
    2.2.6 目的片段的纯化与回收  37-38
    2.2.7 PCR 产物的克隆与序列测定  38-40
    2.2.8 序列的拼接与分析  40
  2.3 结果与分析  40-62
    2.3.1 CAEV 的增殖  40-41
    2.3.2 CAEV89-GB1026 全基因组序列的克隆  41
    2.3.3 CAEV89-GB1026 全基因组序列解析  41-42
    2.3.4 5’-LTR 分析  42-44
    2.3.5 结构蛋白分析  44-56
    2.3.6 调节蛋白分析  56-59
    2.3.7 3’-LTR 分析  59-60
    2.3.8 同源性分析  60-62
  2.4 讨论  62-64
    2.4.1 CAEV 全基因组克隆和分析  62-63
    2.4.2 遗传进化分析  63-64
  2.5 小结  64-65
第三章 CAEV 环介导等温扩增（LAMP）检测方法的建立  65-77
  3.1 材料  65-66
    3.1.1 毒株及血清  65
    3.1.2 待检样品  65
    3.1.3 主要试剂  65-66
  3.2 方法  66-69
    3.2.1 引物设计  66
    3.2.2 检测样品的处理  66-67
    3.2.3 琼脂糖凝胶扩散实验  67
    3.2.4 DNA 的提取  67
    3.2.5 LAMP 反应和结果判定  67-68
    3.2.6 LAMP 的灵敏性实验  68
    3.2.7 PCR 检测  68-69
  3.3 结果  69-75
    3.3.1 LAMP 引物的筛选  69-70
    3.3.2 LAMP 灵敏性实验  70
    3.3.3 LAMP 定量试验  70-71
    3.3.4 样品处理方法的确定  71-72
    3.3.5 样品检测结果  72-75
  3.4 讨论  75-76
    3.4.1 CAEV LAMP 检测方法的建立  75
    3.4.2 关于LAMP 检测方法  75-76
  3.5 小结  76-77
第四章 CAEV 衣壳蛋白P25 的原核表达与纯化  77-95
  4.1 材料  77-80
    4.1.1 载体与菌株  77
    4.1.2 主要试剂  77-80
  4.2 方法  80-86
    4.2.1 P25 蛋白特性的生物信息学分析  80
    4.2.2 引物的设计与合成  80
    4.2.3 P25 原核重组表达载体的构建  80-82
    4.2.4 重组表达菌的诱导表达  82
    4.2.5 SDS-聚丙烯凝胶电泳  82-83
    4.2.6 表达蛋白的纯化  83-84
    4.2.7 Western blot 分析  84-85
    4.2.8 ELISA 检测方法的初步建立  85-86
  4.3 结果  86-92
    4.3.1 CAEV P25 蛋白及拟表达重组蛋白的特性分析  86-88
    4.3.2 重组表达载体的鉴定  88-89
    4.3.3 重组菌的诱导表达和纯化  89-90
    4.3.4 重组蛋白的特异性鉴定  90
    4.3.5 ELISA 检测方法的初步建立  90-92
  4.4 讨论  92-94
    4.4.1 衣壳蛋白P25 的重组表达  92-93
    4.4.2 CAEV 感染的ELISA 检测方法的建立  93-94
  4.5 小结  94-95
第五章 结论  95-96
参考文献  96-107
附录1 缩略词表  107-108
附录2 主要仪器  108-109
附录3 主要生化试剂  109-110
附录4 CAEV89-GB1026（Shanxi）株全基因组解析  110-116
发表论文和科研情况说明  116-117
致谢  117

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 山羊
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