学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

鹅CYP7A1基因克隆、表达调节及表达规律的研究

作　者: 杨堃
导　师: 龙良启
学　校: 华中农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 鹅肥肝 胆固醇-7α羟化酶 mRNA差异显示 原核表达 蛋白免疫印迹
分类号: S835
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 36次
引　用: 1次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


目前,鹅肥肝(fatty liver)的研究主要集中在遗传和环境等方面因素,对其形成分子机理的研究还很缺乏。胆固醇转化为胆汁酸是体内胆固醇代谢的重要途径,通常情况下由胆固醇7α羟化酶(cholesterol 7αhydroxylase, CYP7A1)为起始的经典途径在胆汁酸合成中占主导地位。CYP7A1是胆固醇转化为胆汁酸经典途径的限速酶,它特异性存在于肝细胞微粒体内,属于细胞色素P450酶类,其表达水平的高低反映了胆汁酸合成的快慢。本研究以朗德鹅和溆浦鹅为试验材料,利用mRNA差异显示技术和荧光定量PCR技术,对两个品种之间、肥肝和普通肝脏之间差异表达基因进行了分离和鉴定,在鹅肥肝相关基因的的筛选中,通过mRNA差异显示发现了一条鹅肥肝相关基因片段表达序列标签(EST),进一步通过RACE等技术克隆出该基因的全长cDNA序列。经检索GerieBank,这个DNA片段与鸡的CYP7A1有93%的同源性。实时定量PCR结果证实了该基因超饲养过程中被显著抑制了。为了进一步研究CYP7A1在鹅肝脂肪代谢发生、发展中的作用,构建了CYP7A1原核表达载体pET-28(a)-cyp7al,在大肠杆菌BL21中通过IPTG诱导CYP7A1融合蛋白表达,并经Ni2+柱纯化,将其作为抗原免疫小鼠,制备鼠抗鹅CYP7A1多克隆抗体,纯化抗体后,通过western blot方法在蛋白水平检测该基因在肥肝和普通肝中的表达情况,结果显示CYP7A1的表达水平在肥肝中被下调了。

全文目录


摘要  6-7
Abstract  7-8
缩略语表  8-9
1 文献综述  9-14
  1.1 鹅肥肝的介绍  9-12
    1.1.1 鹅肥肝的概念  9
    1.1.2 鹅肥肝生产现状  9-10
    1.1.3 形成鹅肥肝的机理研究进展  10-11
    1.1.4 鹅生产肥肝性能差异原因的研究  11-12
  1.2 胆汁酸代谢及其对胆固醇7α-羟化酶(CYP7A1)基因表达的调节  12-14
    1.2.1 胆汁酸合成途径  12
    1.2.2 CYP7A1基因的特点  12
    1.2.3 胆汁酸对胆固醇7α-羟化酶的调节  12-14
2 研究目的与意义  14-15
3 材料与方法  15-36
  3.1 实验材料  15-17
    3.1.1 试验鹅的饲养和组织样品的采集  15
    3.1.2 主要试剂来源与配制  15-16
    3.1.3 载体与菌株  16
    3.1.4 主要仪器和设备  16-17
  3.2 实验方法  17-36
    3.2.1 鹅肝脏差异表达基因的分离和鉴定  17-24
    3.2.2 鹅肝CYP7A1的5′端和3′端未知序列扩增  24-30
    3.2.3 cyp7a1基因的原核表达及Western blot检测  30-36
4 结果与分析  36-48
  4.1 鹅肝脏差异表达基因的分离和鉴定  36-40
    4.1.1 总RNA的定量分析  36
    4.1.2 鹅肝脏差异表达基因的分离  36-37
    4.1.3 基因9302的克隆、鉴定、序列分析和组织表达特征分析  37-40
  4.2 鹅肝CYP7A1的5′端和3′端未知序列扩增  40-44
    4.2.1 总RNA的分析  40
    4.2.2 已知序列验证  40-41
    4.2.3 5′RACE PCR产物电泳检测及克隆测序  41-42
    4.2.4 3′端同源序列扩增  42
    4.2.5 3′端cDNA扩增  42-43
    4.2.6 全长序列的获得及序列分析  43-44
  4.3 cyp7A1基因的原核表达及Western blot检测  44-48
    4.3.1 Cyp7a1基因全长CDS扩增和重组表达载体酶切鉴定  44-45
    4.3.2 重组质粒的诱导表达及SDS-PAGE分析  45-46
    4.3.3 重组pET-28(a)-cyp7a1表达蛋白的纯化  46
    4.3.4 Western blot检测正常肝脏和肥肝CYP7A1的表达  46-48
5 讨论  48-50
6 结论  50-51
参考文献  51-57
附录  57-61
致谢  61

相似论文

  1. 拟南芥胱硫醚-γ-合成酶（D-AtCGS）基因在大肠杆菌中的表达及抗血清制备,Q943.2
  2. 南极冰藻GPx、GST和SAHH基因的克隆、定量分析及原核表达载体的构建,Q943.2
  3. 草鱼呼肠孤病毒vp5、vp7基因cDNA的克隆、表达及VP5、VP7蛋白亚细胞定位研究,S941.41
  4. 草鱼呼肠孤病毒vp6和ns38基因的克隆、表达及VP6和NS38免疫原性研究,S941.41
  5. 小麦黄花叶病毒（WYMV）RNA2编码基因的功能研究,S435.121
  6. 红笛鲷清道夫受体B型Ⅰ类和抗冻蛋白Ⅱ型基因的克隆、表达与定量分析,S917.4
  7. 羊种布鲁氏菌16M优势蛋白抗原的鉴定,S852.61
  8. 鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及S1、N基因的序列分析,S852.65
  9. 猪细小病毒河南流行株的分离、鉴定及部分生物学特性研究,S852.65
  10. 人源β-防御素-6的原核表达及纯化,Q78
  11. 圆眼珍珠蛙（Lepidobatrachus laevis）皮肤cDNA文库的构建、筛选及胰蛋白酶抑制剂的原核表达和活性研究,Q78
  12. 新型菊酯类农药降解酶的生化鉴定及分子改造研究,X172
  13. 棉铃虫与烟夜蛾寄主选择机制的比较研究,S435.622.3
  14. 萝卜镉胁迫响应相关基因克隆及其表达分析,S631.1
  15. 开填体重和饲喂油脂对朗德鹅肥肝性能的影响,S835
  16. 兔源支气管败血波氏杆菌PRN蛋白的表达及其免疫保护性研究,S855.12
  17. 兔支气管败血波氏杆菌fimN基因的克隆表达及快速检测方法的建立,S858.291
  18. 栽培大豆和滩涂野大豆及其杂交后代苗期耐盐性与NHX1基因功能的初步研究,S565.1
  19. 新疆沙冬青（Ammopiptanthus nanus）抗寒相关基因的分子克隆及表达分析,S793.9
  20. 栽培大豆和滩涂野大豆及其杂交后代CLC1基因鉴定和功能的初步研究,S565.1
  21. 草鱼NCCRP-1和IL-10基因的克隆和表达,S917.4

中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家禽 > 鹅
© 2012 www.xueweilunwen.com