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海分枝杆菌（Mycobacterium marinum）的分离鉴定及其抗原性研究

作　者: 孟鹏
导　师: 战文斌
学　校: 中国海洋大学
专　业: 水产养殖
关键词: 黑鮶海分枝杆菌 HSP65基因细胞壁蛋白蛋白等电点 LPS 抗原性
分类号: S941
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

海分枝杆菌是一种能够同时感染水产动物及人的病原菌。目前已有许多关于海分枝杆菌对人类感染的病例报道,但是鲜见从水产动物机体分离到该病菌的报道。本实验对黑鮶各组织器官进行菌株分离,在与患者病灶分离菌比较的基础上,通过生理生化、基因序列以及反相高效液相色谱技术将其鉴定为海分枝杆菌。通过不同碳源成分的培养基培养,研究菌株对碳源的选择。用该菌株免疫大鼠制备抗血清,间接免疫荧光抗体方法检测其抗血清的特异性。提取28℃、34℃及37℃培养的菌株细胞壁蛋白,通过SDS-PAGE、Western-blot和双向电泳技术分析蛋白的结构组成及其抗原性差异。并用酚-氯仿-甲醇法、乙醇-酚水法和传统热酚水法提取菌株FZ09的脂多糖,通过高碘酸氧化免疫印迹及血清学检测等技术分析比较各方法提取的脂多糖抗原性差异。本实验为海分枝杆菌的致病成分及亚单位疫苗的研究奠定理论基础。具体方法和结果如下：本研究从黑鮶粘液、背鳍、鳃等部位分离到同一菌株FZ09,将其与海分枝杆菌R1同时进行人工感染,黑鮶感染一个月后仍然保持健康状态,所有浓度组均无发病现象,死亡率为0。分别抽取感染R1及菌株FZ09的黑鮶进行菌株再分离,均可从黑鮶粘液,背鳍等部位分离到原感染菌。经形态学观察、生理生化特性、HSP65基因测序及反相高效液相色谱技术(HPLC)分析,菌株FZ09生理生化特性与海分枝杆菌R1相同。抗酸染色为阳性,小黄花菜状、没有鞭毛,有分枝趋势,直径1-10μm；见光产生黄色素,系统发育树表明FZ09确与M. marinum(AJ307636)和M.marinum (MMU55831)聚为一个分支的置信度较高,为85%。综合上述特征及分枝菌酸图谱显示菌株FZ09为海分枝杆菌。表明菌株FZ09与肉芽肿病患者病灶处分离的菌株属同一菌株,同时说明这种携带海分枝杆菌感染而不发病死亡的硬棘水产动物可能通过刺伤而间接感染软棘鱼类和人,海分枝杆菌起源于水产动物。分别用Na2CO3、Tween80、Tween20取代培养基中的碳源成分—甘油,培养海分枝杆菌FZ09四周,菌落生长结果显示：与Na2CO3、Tween80、Tween20相比,甘油仍然是最好的碳源成分,可以促进海分枝杆菌生长旺盛。Tween80在快速鉴定分枝杆菌菌种方面具有一定的优势,海分枝杆菌对于有机碳源的选择与结核分枝杆菌存在区别。用菌株FZ09的全菌免疫大鼠,发现FZ09能有效地刺激大鼠产生免疫应答反应,产生抗血清。酶联免疫吸附法(ELISA)测得血清抗体效价为6400。免疫荧光抗体技术(IFAT)检测表明该血清与菌株FZ09发生特异性结合,与结核分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌发生交叉反应,与非分枝杆菌属细菌则没有交叉。提取28℃、34℃及37℃培养的菌株FZ09的细胞壁蛋白,通过SDS-PAGE、Western-blot及双向电泳技术分析其主要组成结构,结果表明,在28℃、34℃培养条件下,该海分枝杆菌的细胞壁蛋白条带分布相同,主要有：97 kDa、84 kDa、56 kDa、50 kDa、45 kDa、35 kDa、28 kDa、23 kDa、19 kDa、11 kDa。而其中仅有45 kDa蛋白条带具有良好的抗原性,蛋白等电点分布于pH4.5-5.5之间。37℃培养时的蛋白条带明显减少,缺少的主要条带有23 kDa、19 kD和11 kDa,并且没有抗原免疫蛋白带,等电点分布区域相应减少。说明37℃时,菌株可能改变细胞结构,失去了抗原性。45 kDa蛋白可能与海分枝杆菌FZ09的抗原特异性和致病性有关,并有可能作为制备海分枝杆菌亚单位疫苗的候选材料。分别用酚-氯仿-甲醇法、乙醇-酚水法和传统热酚水法提取菌株FZ09的脂多糖(LPS),通过SDS-PAGE和高碘酸氧化免疫印迹法分析比较三种方法所提LPS的组成和抗原性差异,并通过高碘酸氧化ELISA检测血清与抗体结合的敏感性。结果表明乙醇-酚水法提取的LPS含量和纯度最高,LPS的抗原性保持较好。三种方法提取的LPS条带分布范围基本相同,主要条带分子量分别为14、16和23 kd。鼠抗海分枝杆菌血清主要与LPS的核心多糖部分相结合,并且形成块状结构。用温和高碘酸处理后,核心多糖不再被识别,并且导致ELISA吸光度值急剧下降。此外,进行血清学检测时发现：海分枝杆菌对腹腔注射组的昆明鼠具有感染能力,其肝脏出现肉芽肿；以细菌脂多糖作为反应底物的敏感度要明显高于细菌全菌,而且各感染组都表现为明显的阳性结果：其次,昆明鼠各感染组的值要显著高于大鼠各组。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-10
1 前言  10-23
  1.1 海分枝杆菌的研究背景  10
  1.2 海分枝杆菌的分类鉴定概述  10-14
  1.3 海分枝杆菌的特性概述  14-20
  1.4 海分枝杆菌疾病诊断治疗技术  20-23
2 黑鮶体表海分枝杆菌的分离鉴定及其培养基的选择  23-36
  2.1 细菌的分离及培养特性  23-29
  2.2 菌株FZ09的鉴定  29-33
  2.3 海分枝杆菌FZ09培养基碳源的选择  33-36
3 鼠抗FZ09血清的制备及其特异性分析  36-43
  3.1 菌株FZ09抗血清的制备过程  36-40
  3.2 抗海分枝杆菌FZ09血清的特异性分析  40-43
4 海分枝杆菌特性分析  43-62
  4.1 不同温度下海分枝杆菌FZ09细胞壁蛋白的特性比较  43-49
  4.2 海分枝杆菌FZ09脂多糖的抗原性  49-62
小结  62-64
参考文献  64-71
附录  71-76
致谢  76

海分枝杆菌（Mycobacterium marinum）的分离鉴定及其抗原性研究

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