学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

构建大容量噬菌体抗体库

作　者: 潘博
导　师: 魏萍
学　校: 东北农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 噬菌体抗体库 人源单克隆抗体 Cre-Loxp定位重组系统 Fab抗体
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 78次
引　用: 1次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


噬菌体抗体库是把体外随机组合的全套抗体基因呈现在丝状噬菌体表面,通过抗原的亲和力选择和噬菌体扩增获得特异性抗体基因的技术。该技术已广泛用于制备人源单克隆抗体及免疫学研究中。本研究通过构建噬粒载体并利用噬菌体抗体库技术和Cre-Loxp定位重组系统,构建了一个大容量天然噬菌体抗体库。我们采集了120人份正常人的外周血,分离淋巴细胞,提取细胞总RNA反转录cDNA,分别以不同的人源抗体基因引物扩增抗体轻、重链基因。首先将轻链基因按照人类抗体基因使用频率的比例混和,插入到PDF-D-SacB质粒中,通过多次电转化,收获含有轻链库的质粒；然后将重链基因按照人类抗体基因使用频率的比例混合后,插入到轻链质粒获得初级非免疫抗体库。初级噬菌体抗体库以高感染复数(MOI>100：1)感染能分泌重组酶的大肠杆菌BS1365,使多个噬菌体同时感染一个细菌,30℃低温诱导定点重组,即VL与VH发生重组,收获的重组噬菌体抗体库以低感染复述(MOI<100：1)感染大肠杆菌Trans1-Blue,收获噬菌体获得含有1.0×1011克隆的噬菌体抗体库,随机挑取10个克隆鉴定,轻链和重链均有插入的10个克隆,插入率为100%。通过以上实验得到了以下结论：本研究获得所有VL和VH亚类基因,扩增产物片段大小均与理论值相符；利用噬菌体抗体库技术和Cre-Loxp定位重组系统,构建了一个大容量的人源天然噬菌体抗体库；轻重链基因的克隆效率均为100%。初级库容量为7.2×1012,滴度为6×1013；重组后的工作库有效容量为1.0×1011,滴度至少为1.0×1013。

全文目录


中文摘要  8-9
英文摘要  9-10
1 引言  10-20
  1.1 基因工程抗体药物的概述  10-11
    1.1.1 基因工程抗体药物的发展背景  10
    1.1.2 基因工程抗体研究的两个重要技术  10-11
  1.2 噬菌体展示技术  11-13
    1.2.1 噬菌体抗体库基本原理  11-12
    1.2.2 噬菌体展示系统  12-13
  1.3 噬菌体抗体库技术  13-16
    1.3.1 噬菌体抗体库基本原理  13-14
    1.3.2 噬菌体抗体库的构建及筛选  14-16
  1.4 噬菌体抗体库的应用现状  16-18
    1.4.1 医学微生物学领域的应用  16
    1.4.2 自身免疫性疾病研究方面的应用  16
    1.4.3 肿瘤研究方面的应用  16-17
    1.4.4 诊断和治疗方面的应用  17-18
  1.5 展望  18-19
  1.6 研究的目的和意义  19-20
2 材料与方法  20-41
  2.1 实验材料  20-24
    2.1.1 菌种及毒株  20
    2.1.2 质粒  20
    2.1.3 工具酶  20
    2.1.4 相关试剂及试剂盒  20-21
    2.1.5 常用溶液配制  21
    2.1.6 主要仪器  21
    2.1.7 引物  21-24
  2.2 实验方法  24-41
    2.2.1 验证PUC19-SacB的自杀功能  24
    2.2.2 构建噬粒载体PDF-SacB-BX(PSBX)  24-28
    2.2.3 构建噬粒载体PDF-SacB-GX(PSGX)  28-29
    2.2.4 构建PDF-D-SacB  29-30
    2.2.5 淋巴细胞的分离及总RNA的提取  30-31
    2.2.6 反转录cDNA的合成  31-32
    2.2.7 PCR扩增Fab抗体基因  32-34
    2.2.8 PCR产物的纯化  34
    2.2.9 噬粒载体PDF-D-SacB的制备  34-35
    2.2.10 轻链库的构建及鉴定  35-37
    2.2.11 辅助噬菌体VCSM 13的制备  37
    2.2.12 辅助噬菌体VCSM 13滴度的测定  37
    2.2.13 噬菌体抗体Fab库的构建和鉴定  37-39
    2.2.14 重组噬菌体抗体库的构建  39
    2.2.15 工作库的构建及鉴定  39-41
3 结果  41-52
  3.1 构建噬粒载体PDF-D-SacB  41-47
    3.1.1 验证PUC19-SacB的自杀功能  41-42
    3.1.2 构建噬粒载体PDF-SacB-BX(PSBX)  42-44
    3.1.3 构建噬粒载体PDF-SacB-GX(PSGX)  44-45
    3.1.4 构建噬粒载体PDF-D-SacB  45-47
  3.2 PCR扩增IgG、IgM重链Fd基因和Vκ、Vλ基因  47-48
  3.3 噬粒载体PDF-D-SacB的制备  48-49
  3.4 轻链库的构建及鉴定  49-50
  3.5 辅助噬菌体VCSM 13的扩增和滴度的测定  50
  3.6 初级Fab抗体库的构建及鉴定  50
  3.7 大容量噬菌体抗体库的构建及鉴定  50-52
4 讨论  52-56
  4.1 带有自杀功能的噬粒载体  52-53
  4.2 噬粒载体酶切位点的改造  53-54
  4.3 抗体基因的克隆  54
  4.4 重组子的转化  54
  4.5 Cre-Loxp系统  54-56
5 结论  56-58
致谢  58-60
参考文献  60-66
攻读硕士学位期间发表的学术论文  66

相似论文

  1. 人源Fab噬菌体抗体库的构建及抗IL-4抗体的初步筛选,R392
  2. 胰淀素人源性Fab抗体的筛选及鉴定,R392
  3. 人源性抗百草枯特异性单链抗体的筛选及初步鉴定,R392
  4. 人源尘肺病噬菌体单链抗体库的构建和初步鉴定,R392
  5. 斑点叉尾鮰天然单链噬菌体抗体库的构建及初步鉴定,R392
  6. 人源抗伊维菌素单链抗体的筛选、表达及结构功能分析,R392
  7. 全人源抗CCR7噬菌体单链抗体的筛选及初步鉴定,R392
  8. 鱼源Fab噬菌体抗体库的筛选、鉴定及抗SAs抗体的可溶性表达,S917.4
  9. 胃癌人源性ScFv噬菌体单链体库的构建和初步鉴定,R735.2
  10. 磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的原核表达以及单抗的筛选和制备,R735.7
  11. 丁香假单胞菌极毛蛋白HrpA的克隆表达与单链抗体的制备,S432.4
  12. 抗VEGFR-2嵌合Fab抗体对鼠肝癌原位移植瘤及其新生血管的抑制作用,R735.7
  13. 人乳腺癌噬菌体抗体库的建立、筛选及抗hPRLR抗体的鉴定,R737.9
  14. 超大容量人源噬菌体抗体库的构建及禽流感病毒抗体的筛选,R392
  15. 自身免疫抗体噬菌体库的构建及初步鉴定,R392
  16. 新型基因工程抗体scFab的构建、表达及活性检测,R346
  17. 呼吸道合胞病毒融合蛋白人源性单链抗体的构建及初步鉴定,R392
  18. B细胞淋巴瘤Fab噬菌体抗体库的构建、筛选及鉴定,R733.1
  19. 人源天然Fab噬菌体抗体库的构建及抗c-Met抗体的筛选、鉴定,R392
  20. 抗人肝纤维化噬菌体单链抗体初级库的构建,R575.2

中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学
© 2012 www.xueweilunwen.com