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丁香假单胞菌极毛蛋白HrpA的克隆表达与单链抗体的制备
作 者: 刘海荣
导 师: 汪世华
学 校: 福建农林大学
专 业: 微生物学
关键词: Ⅲ型分泌系统 HrpA scFv 噬菌体抗体库
分类号: S432.4
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要
大多数的植物病原菌如Pseudomonas、Erwinia、Xanthomonas和Ralstonia都含有hrp基因(hypersensitive response and pathogenicity genes)。这些病原菌的hrp基因不仅控制着在宿主植物上引起致病性,而且控制着在非宿主植物上引起超敏反应(hypersensitive response)。病原菌在侵入植物细胞时,hrp基因簇中的结构基因编码的蛋白质,会在病原菌表面形成一种丝状的类似鞭毛的附属物,称为Hrp极毛(Hrp pilus)。病原菌能否使亲和性的植物发病与其有无Hrp极毛有直接的关系,Hrp极毛在植物与病原菌的相互作用中扮演十分重要的角色。我们通过NCBI找到P. syringae pv. tomato DC3000的Hrp极毛蛋白HrpA的序列,将其克隆到pET32a(+)载体上,制备人工表达的HrpA蛋白抗原,在后续试验中,我们需要测定免疫小鼠的血清效价,为排除融合蛋白硫氧还蛋白(Trx)的干扰,我们又把它克隆到pET28a(+)载体上,并表达纯化目的蛋白用于检测。以纯化的目的蛋白(由载体pET32a(+)-HrpA表达)免疫Balb/c雌性小鼠,达到一定效价后,提取脾脏总RNA经反转录得到cDNA,扩增得到VL和VH,通过组装得到scFv基因。然后将其构建到噬菌体载体pCANTAB-5E上,建立噬菌体单链抗体初级文库。通过富集淘选过程后,最终选出亲和力最高的单链抗体,命名为SF1,最后在HB2151中进行了可溶性表达,为进一步转植物和植物抗体的研究提供了材料。
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全文目录
摘要 8-9 Abstract 9-10 英文缩写表 10-11 1 综述 11-18 引言 11 1.1 植物病原菌 11-14 1.1.1 植物病原菌的Ⅲ型分泌系统 11-12 1.1.2 Hrp 基因簇 12-13 1.1.3 Hrp 极毛与HrpA 蛋白 13-14 1.1.4 Hrp 基因的诱导表达和调控 14 1.2 植物的抗病性 14-15 1.2.1 病原菌的无毒基因 14-15 1.2.2 植物的抗病基因 15 1.3 基因工程抗体技术 15-17 1.3.1 单链抗体 15-16 1.3.2 噬菌体展示技术 16 1.3.3 植物抗体工程 16-17 1.4 本研究目的意义 17-18 2 丁香假单胞菌极毛蛋白HrpA 的克隆表达与鉴定 18-39 引言 18 2.1 实验材料 18-20 2.1.1 菌株与载体 18-19 2.1.2 主要试剂 19 2.1.3 主要仪器 19-20 2.1.4 培养基 20 2.2 实验方法 20-29 2.2.1 引物设计与合成 20-21 2.2.2 P. syringae pv. tomato DC3000 基因组的提取 21-22 2.2.3 PCR 扩增HrpA 基因 22 2.2.4 表达载体pET32a(+)-HrpA 的构建 22-24 2.2.4.1 pET32a(+)质粒的提取 22-23 2.2.4.2 目的基因与质粒的酶切 23-24 2.2.4.3 目的片段与载体的连接 24 2.2.5 E.coli DH5α感受态细胞的制备 24-25 2.2.6 转化实验 25 2.2.7 重组质粒的筛选与验证 25 2.2.8 菌株的测序 25-26 2.2.9 融合蛋白的诱导表达 26-27 2.2.9.1 质粒提取与表达宿主E.coli BL21 的转化 26 2.2.9.2 IPTG 诱导表达 26 2.2.9.3 SDS-PAGE 分析 26-27 2.2.10 融合蛋白的大量纯化 27-28 2.2.11 表达载体pET28a(+)-HrpA 的构建以及目的蛋白的诱导纯化 28 2.2.12 蛋白质的浓度测定 28-29 2.3 结果与分析 29-37 2.3.1 P. syringae pv. tomato DC3000 基因组的提取 29 2.3.2 PCR 扩增目的基因 29-30 2.3.3 表达载体pET32a(+)-HrpA 的构建 30-32 2.3.4 表达载体pET28a(+)-HrpA 的构建 32-33 2.3.5 测序结果 33-34 2.3.6 融合蛋白的表达和纯化 34-35 2.3.7 蛋白浓度测定 35-37 2.4 讨论 37-38 2.4.1 关于HrpA 基因的引物设计 37 2.4.2 表达载体pET32a(+)-HrpA 的构建过程 37 2.4.3 融合蛋白诱导表达与纯化 37-38 2.5 结论 38-39 3 单链抗体的制备 39-69 引言 39-40 3.1 实验材料 40-42 3.1.1 菌株与载体 40 3.1.2 主要试剂 40 3.1.3 主要仪器材料 40-41 3.1.4 抗体可变区的通用引物 41-42 3.1.5 培养基 42 3.2 实验方法 42-56 3.2.1 小鼠的免疫 42-43 3.2.2 血清效价的测定 43-44 3.2.3 脾脏总RNA 的提取 44 3.2.4 cDNA 的反转录合成(RT-PCR) 44-45 3.2.5 重链基因可变区(VH)的扩增 45 3.2.6 轻链基因可变区(VL)的扩增 45-46 3.2.7 scFv 的组装与扩增 46-47 3.2.8 基因(scFv)与载体(pCANTAB 5E)的酶切 47-48 3.2.9 基因(scFv)与载体(pCANTAB 5E)的连接 48 3.2.10 单链抗体原始库菌株的建立 48-50 3.2.10.1 E.coli TG1 电转感受态细胞的制备 48-49 3.2.10.2 电击转化 49-50 3.2.11 噬菌体抗体初级库的制备 50 3.2.12 抗体初级库的库容量测定 50-51 3.2.13 噬菌体抗体库的富集淘选 51-52 3.2.14 特异性的单链抗体的获得 52-53 3.2.14.1 噬菌体抗体准备阶段 52 3.2.14.2 ELISA 方法的检测阶段 52-53 3.2.15 阳性克隆的酶切与PCR 验证 53 3.2.16 阳性克隆的ELISA 检测 53 3.2.17 菌株的测序 53-54 3.2.18 单链抗体的可溶性表达 54-55 3.2.18.1 宿主菌E.coli HB2151 的侵染阶段 54 3.2.18.2 抗体的可溶性表达阶段 54-55 3.2.19 抗体特异性与活性检测 55-56 3.2.19.1 ELISA 方法的检测抗体特异性 55 3.2.19.2 Far western blot 检测抗体活性 55-56 3.3 结果与分析 56-66 3.3.1 血清效价的测定 56-57 3.3.2 脾脏总RNA 的提取 57 3.3.3 重链基因可变区(VH)的扩增 57-58 3.3.4 轻链基因可变区(VL)的扩增 58 3.3.5 scFv 的组装与扩增 58-59 3.3.6 单链抗体原始库菌株的建立 59 3.3.7 噬菌体单链抗体库富集淘选 59-60 3.3.8 特异性的单链抗体的获得 60-61 3.3.9 scFv 的PCR 和酶切验证 61-62 3.3.10 scFv 的ELISA 检测 62-63 3.3.11 scFv 的测序结果与分析 63 3.3.12 scFv 的可溶性表达 63-64 3.3.13 ELISA 方法检测抗体特异性 64-65 3.3.14 Far western blot 检测抗体活性 65-66 3.5 讨论 66-68 3.5.1 BalB/C 小鼠的免疫 66 3.5.2 脾脏总RNA 的提取 66 3.5.3 scFv 的组装与扩增 66-67 3.5.4 电击转化法 67 3.5.5 噬菌体抗体库富集淘选过程 67 3.5.6 特异性的单链抗体的获得 67 3.5.7 Far western blot 检测抗体活性 67-68 3.6 结论 68-69 参考文献 69-75 附录 75-78 致谢 78
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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 植物病害及其防治 > 侵(传)染性病害
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