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丁香假单胞菌极毛蛋白HrpA的克隆表达与单链抗体的制备

作 者: 刘海荣
导 师: 汪世华
学 校: 福建农林大学
专 业: 微生物学
关键词: Ⅲ型分泌系统 HrpA scFv 噬菌体抗体库
分类号: S432.4
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
下 载: 20次
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内容摘要


大多数的植物病原菌如Pseudomonas、Erwinia、Xanthomonas和Ralstonia都含有hrp基因(hypersensitive response and pathogenicity genes)。这些病原菌的hrp基因不仅控制着在宿主植物上引起致病性,而且控制着在非宿主植物上引起超敏反应(hypersensitive response)。病原菌在侵入植物细胞时,hrp基因簇中的结构基因编码的蛋白质,会在病原菌表面形成一种丝状的类似鞭毛的附属物,称为Hrp极毛(Hrp pilus)。病原菌能否使亲和性的植物发病与其有无Hrp极毛有直接的关系,Hrp极毛在植物与病原菌的相互作用中扮演十分重要的角色。我们通过NCBI找到P. syringae pv. tomato DC3000的Hrp极毛蛋白HrpA的序列,将其克隆到pET32a(+)载体上,制备人工表达的HrpA蛋白抗原,在后续试验中,我们需要测定免疫小鼠的血清效价,为排除融合蛋白硫氧还蛋白(Trx)的干扰,我们又把它克隆到pET28a(+)载体上,并表达纯化目的蛋白用于检测。以纯化的目的蛋白(由载体pET32a(+)-HrpA表达)免疫Balb/c雌性小鼠,达到一定效价后,提取脾脏总RNA经反转录得到cDNA,扩增得到VL和VH,通过组装得到scFv基因。然后将其构建到噬菌体载体pCANTAB-5E上,建立噬菌体单链抗体初级文库。通过富集淘选过程后,最终选出亲和力最高的单链抗体,命名为SF1,最后在HB2151中进行了可溶性表达,为进一步转植物和植物抗体的研究提供了材料。

全文目录


摘要  8-9
Abstract  9-10
英文缩写表  10-11
1 综述  11-18
  引言  11
  1.1 植物病原菌  11-14
    1.1.1 植物病原菌的Ⅲ型分泌系统  11-12
    1.1.2 Hrp 基因簇  12-13
    1.1.3 Hrp 极毛与HrpA 蛋白  13-14
    1.1.4 Hrp 基因的诱导表达和调控  14
  1.2 植物的抗病性  14-15
    1.2.1 病原菌的无毒基因  14-15
    1.2.2 植物的抗病基因  15
  1.3 基因工程抗体技术  15-17
    1.3.1 单链抗体  15-16
    1.3.2 噬菌体展示技术  16
    1.3.3 植物抗体工程  16-17
  1.4 本研究目的意义  17-18
2 丁香假单胞菌极毛蛋白HrpA 的克隆表达与鉴定  18-39
  引言  18
  2.1 实验材料  18-20
    2.1.1 菌株与载体  18-19
    2.1.2 主要试剂  19
    2.1.3 主要仪器  19-20
    2.1.4 培养基  20
  2.2 实验方法  20-29
    2.2.1 引物设计与合成  20-21
    2.2.2 P. syringae pv. tomato DC3000 基因组的提取  21-22
    2.2.3 PCR 扩增HrpA 基因  22
    2.2.4 表达载体pET32a(+)-HrpA 的构建  22-24
      2.2.4.1 pET32a(+)质粒的提取  22-23
      2.2.4.2 目的基因与质粒的酶切  23-24
      2.2.4.3 目的片段与载体的连接  24
    2.2.5 E.coli DH5α感受态细胞的制备  24-25
    2.2.6 转化实验  25
    2.2.7 重组质粒的筛选与验证  25
    2.2.8 菌株的测序  25-26
    2.2.9 融合蛋白的诱导表达  26-27
      2.2.9.1 质粒提取与表达宿主E.coli BL21 的转化  26
      2.2.9.2 IPTG 诱导表达  26
      2.2.9.3 SDS-PAGE 分析  26-27
    2.2.10 融合蛋白的大量纯化  27-28
    2.2.11 表达载体pET28a(+)-HrpA 的构建以及目的蛋白的诱导纯化  28
    2.2.12 蛋白质的浓度测定  28-29
  2.3 结果与分析  29-37
    2.3.1 P. syringae pv. tomato DC3000 基因组的提取  29
    2.3.2 PCR 扩增目的基因  29-30
    2.3.3 表达载体pET32a(+)-HrpA 的构建  30-32
    2.3.4 表达载体pET28a(+)-HrpA 的构建  32-33
    2.3.5 测序结果  33-34
    2.3.6 融合蛋白的表达和纯化  34-35
    2.3.7 蛋白浓度测定  35-37
  2.4 讨论  37-38
    2.4.1 关于HrpA 基因的引物设计  37
    2.4.2 表达载体pET32a(+)-HrpA 的构建过程  37
    2.4.3 融合蛋白诱导表达与纯化  37-38
  2.5 结论  38-39
3 单链抗体的制备  39-69
  引言  39-40
  3.1 实验材料  40-42
    3.1.1 菌株与载体  40
    3.1.2 主要试剂  40
    3.1.3 主要仪器材料  40-41
    3.1.4 抗体可变区的通用引物  41-42
    3.1.5 培养基  42
  3.2 实验方法  42-56
    3.2.1 小鼠的免疫  42-43
    3.2.2 血清效价的测定  43-44
    3.2.3 脾脏总RNA 的提取  44
    3.2.4 cDNA 的反转录合成(RT-PCR)  44-45
    3.2.5 重链基因可变区(VH)的扩增  45
    3.2.6 轻链基因可变区(VL)的扩增  45-46
    3.2.7 scFv 的组装与扩增  46-47
    3.2.8 基因(scFv)与载体(pCANTAB 5E)的酶切  47-48
    3.2.9 基因(scFv)与载体(pCANTAB 5E)的连接  48
    3.2.10 单链抗体原始库菌株的建立  48-50
      3.2.10.1 E.coli TG1 电转感受态细胞的制备  48-49
      3.2.10.2 电击转化  49-50
    3.2.11 噬菌体抗体初级库的制备  50
    3.2.12 抗体初级库的库容量测定  50-51
    3.2.13 噬菌体抗体库的富集淘选  51-52
    3.2.14 特异性的单链抗体的获得  52-53
      3.2.14.1 噬菌体抗体准备阶段  52
      3.2.14.2 ELISA 方法的检测阶段  52-53
    3.2.15 阳性克隆的酶切与PCR 验证  53
    3.2.16 阳性克隆的ELISA 检测  53
    3.2.17 菌株的测序  53-54
    3.2.18 单链抗体的可溶性表达  54-55
      3.2.18.1 宿主菌E.coli HB2151 的侵染阶段  54
      3.2.18.2 抗体的可溶性表达阶段  54-55
    3.2.19 抗体特异性与活性检测  55-56
      3.2.19.1 ELISA 方法的检测抗体特异性  55
      3.2.19.2 Far western blot 检测抗体活性  55-56
  3.3 结果与分析  56-66
    3.3.1 血清效价的测定  56-57
    3.3.2 脾脏总RNA 的提取  57
    3.3.3 重链基因可变区(VH)的扩增  57-58
    3.3.4 轻链基因可变区(VL)的扩增  58
    3.3.5 scFv 的组装与扩增  58-59
    3.3.6 单链抗体原始库菌株的建立  59
    3.3.7 噬菌体单链抗体库富集淘选  59-60
    3.3.8 特异性的单链抗体的获得  60-61
    3.3.9 scFv 的PCR 和酶切验证  61-62
    3.3.10 scFv 的ELISA 检测  62-63
    3.3.11 scFv 的测序结果与分析  63
    3.3.12 scFv 的可溶性表达  63-64
    3.3.13 ELISA 方法检测抗体特异性  64-65
    3.3.14 Far western blot 检测抗体活性  65-66
  3.5 讨论  66-68
    3.5.1 BalB/C 小鼠的免疫  66
    3.5.2 脾脏总RNA 的提取  66
    3.5.3 scFv 的组装与扩增  66-67
    3.5.4 电击转化法  67
    3.5.5 噬菌体抗体库富集淘选过程  67
    3.5.6 特异性的单链抗体的获得  67
    3.5.7 Far western blot 检测抗体活性  67-68
  3.6 结论  68-69
参考文献  69-75
附录  75-78
致谢  78

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 植物病害及其防治 > 侵(传)染性病害
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