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超大容量人源噬菌体抗体库的构建及禽流感病毒抗体的筛选

作　者: 方钟
导　师: 罗文新
学　校: 厦门大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 人源噬菌体抗体库 Cre-loxP重组禽流感病毒
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

从20世纪70年代中期杂交瘤技术产生以来,人们一直对利用抗体作为疾病治疗的药物充满了期待。但应用鼠源杂交瘤抗体治疗人类疾病时,结果却令人相当失望。鼠源抗体分子在人体内会作为外来分子被人体免疫系统识别,从而产生人抗鼠抗体反应(human antimurine antibody response,HAM),鼠源抗体在体内引起过敏反应并很快的被人体免疫系统清除掉,从而无法到达治疗的目的。而后一系列的人源抗体技术,为解决这一问题带来了曙光。伴随着鼠抗人源化、人B细胞永生化和抗体基因工程技术的逐渐成熟,不少治疗性抗体也陆续进入临床研究,甚至已经成为上市药物。噬菌体展示抗体库技术因为操作简单,及筛选高通量,成为最便捷最高效的人源抗体技术之一。但是通过常规技术制备的噬菌体抗体库,由于PCR、连接、转化效率等原因,限制了噬菌体抗体库的容量。此外,由于构建的抗体库不能像抗体基因在体内一样,可以发生重排,抗体库的多样性常常受到限制。缺乏多样性的抗体库经过筛选往往不能获得亲和力高、特异性好的克隆。因此,得到库容量高、多样性丰富的抗体库非常重要。而体外重组系统的建立,有利于增加抗体库的多样性。本研究利用72对兼并引物扩增了人抗体可变区基因,通过摸索PCR扩增条件、优化制备电转感受态、提高连接物浓度,成功构建了一个具有良好基因多样性的人源天然噬菌体抗体库,库容为1.47×10~7,并通过菌株改造和突变loxP位点的应用,建立了适于抗体库的Cre-loxP重组系统,使得在Cre酶的作用下不同scFv基因间的VH、VL进行重组,抗体轻重链能够自由随机的组合重排,重组过程可以无限重复,每一次重组的产物都可以作为下次重组的底物,便于以后的筛选和亲和力成熟,最后获得8×10~11超大容量的噬菌体单链抗体库,建立了超大容量抗体库抗体库制备人源抗体的技术平台,为以后针对各种病毒、病原菌、毒素等抗原进行筛选,获得特异性人源治疗性单抗奠定了基础。抗体在阻止病毒入侵宿主细胞,抑制病毒复制方面起着重要的作用。人源抗体技术的发展,也为病毒性疾病的治疗带来了新的亮点。本研究通过固液相及不同H5N1型禽流感病毒株对抗体库进行筛选,经过多毒株三轮淘洗,洗脱下来的噬菌体抗体呈明显增加趋势,表明对病毒HA的噬菌体抗体得到了有效的富集。利用ELISA和HAI等检测手段,获得9株抗体并进行原核表达获得scFv抗体蛋白。其中4株抗体能与H5亚型三株病毒交叉反应,4株中的一株抗体还表现出对H1、H3、H5亚型毒株的强交叉。有望成为禽流感抗体药物,用于高致病性高死亡率流感的治疗。此外,可以用这些抗体寻找HA1上的保守表位,研究流感病毒突变机制,研制通用疫苗。

全文目录

缩略词表  8-9
摘要  9-11
Abstract  11-13
第一章前言  13-28
  1 治疗性抗体  13-15
  2 噬菌体展示抗体库技术  15-19
    2.1 噬菌体展示抗体库  15-18
    2.2 噬菌体抗体库技术面对的问题  18-19
  3 Cre-loxP重组技术  19-22
    3.1 Cre重组酶工作原理  19-20
    3.2 Cre-loxP重组抗体库  20-22
  4 高致病性禽流感  22-26
    4.1 高致病性禽流感的危害  22-24
    4.2 高致病性禽流感的对策  24-26
  5 本研究的目的意义  26-28
第二章材料与方法  28-48
  1 材料  28-33
  2 方法  33-48
    2.1 Cre-loxP重组系统的建立  33-36
    2.2 初级人源天然抗体库的构建  36-43
    2.3 大容量重组库的制备  43-44
    2.4 H5型流感病毒人源抗体的筛选  44-48
第三章结果与分析  48-71
  1 NS3529/F+菌株制备  48-53
    1.1 噬菌体感染NS3529/F+菌株  48-49
    1.2 NS3529/F+重组活性的验证  49-53
  2 抗体库表达载体的改造  53-54
  3 抗体库的构建及鉴定  54-62
    3.1 PCR扩增人源VH和VL基因片  54-56
    3.2 scFv基因片段库的组装  56-58
    3.3 scFv基因与pCANTAB-5EX2载体的酶切  58
    3.4 高效连接物的制备  58-59
    3.5 高效电转感受态的制备  59-60
    3.6 初级抗体库的构建和鉴定  60
    3.7 超大容量抗体库的构建  60-62
  4 抗体库的筛选  62-67
    4.1 液相筛选和固液相交替筛选的比较  64-66
    4.2 噬菌体抗体单克隆检测  66-67
  5 H5型流感病毒人源scFv活性鉴定  67-71
    5.1 HAI检测scFv活性  69
    5.2 ELISA检测scFv活性  69-71
第四章讨论  71-77
  1 抗体库的构建  71-74
    1.1 抗体基因的来源  71-72
    1.2 初级抗体库制备  72
    1.3 大容量重组抗体库制备  72-74
  2 H5型禽流感病毒人源抗体的筛选  74-77
    2.1 抗HA抗体  74-75
    2.2 从抗体库获得流感抗体  75-77
第五章小结  77-78
参考文献  78-88
致谢  88-89
附录  89

超大容量人源噬菌体抗体库的构建及禽流感病毒抗体的筛选

内容摘要

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