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新型基因工程抗体scFab的构建、表达及活性检测

作　者: 石凌超
导　师: 钱旻
学　校: 华东师范大学
专　业: 生物医学
关键词: 苏丹红I 单链Fab抗体包涵体酶联免疫吸附测定
分类号: R346
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

抗体是机体免疫系统针对侵入体内的抗原物质所产生的一种特异性免疫球蛋白,抗体研究的发展经历了多克隆抗体、单克隆抗体和基因工程抗体三个阶段。基因工程抗体是将抗体基因或基因片段通过基因工程技术进行重组,并在不同表达系统中产生的抗体或抗体片段,目前基因工程抗体包括人-鼠嵌合抗体、改型抗体、双特异性抗体、小分子抗体等。所谓小分子抗体是指相对分子质量较小但具有抗原结合功能的抗体分子片段,包括Fab、Fv、scFv等,其中Fab和scFv是目前小分子抗体研究的重点。小分子抗体具有制备方法简单、免疫原性弱、穿透力强等优点,因此在肿瘤导向治疗和病毒性疾病的治疗,以及放射免疫成像检查肿瘤等方面得到了广泛的应用。本课题是在结合小分子抗体Fab和scFv优缺点的基础上,拟克隆抗苏丹红Ⅰ单克隆抗体的编码基因Lc和Fd,并将二者在原核表达载体pET24a内用人工合成的Linker连接,构建成基因工程抗体scFab的表达载体,最后通过原核表达,期望能得到一种兼具scFv和Fab优点的新型基因工程抗体scFab。本论文主要包括以下几个部分:1.从分泌抗苏丹红Ⅰ单克隆抗体的杂交瘤细胞中通过PCR技术获得Lc和Fd基因,克隆至T-A克隆载体后,进行克隆鉴定和DNA测序。DNA序列BLAST和编码蛋白质序列分析表明所得到的抗体基因符合小鼠的IgG基因特征。2.经过对已有载体的改造,重新设计了可以直接用于scFab原核表达的载体;同时,在上述对抗体分析的基础上,选取合适Lc和Fd基因片段,在其两端引入酶切位点后与人工合成的Linker相连,一起克隆到经过改造的载体pET24a(+)中,构建成表达载体pET24a-scFab,成功转染大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。3.IPTG诱导scFab在E.coli BL21(DE3)表达,SDS-PAGE分析和Western Blot鉴定,显示scFab蛋白以包涵体的形式表达,经过对其表达条件进行优化后,获得大量表达的scFab抗体蛋白包涵体。4.尿素溶解scFab包涵体,以含谷胱甘肽氧化还原系统的复性液对其进行复性,透析浓缩得到复性抗体,间接ELISA和竞争ELISA检测结果表明复性抗体对苏丹红Ⅰ具有很高的结合活性和结合特异性。论文结论:本研究成功构建了一种新型基因工程抗体scFab,为新型基因工程抗体研究奠定了初步的理论和实验基础。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-11
绪论  11-16
第一章抗苏丹红I单克隆抗体轻链及重链Fd基因的克隆  16-30
  一、实验材料、试剂与仪器  16-20
  二、实验方法  20-25
  三、结果与分析  25-28
  四、讨论  28-29
  五、本章小结  29-30
第二章抗苏丹红 I scFab抗体表达载体的构建  30-50
  一、实验材料、试剂与仪器  30
  二、实验设计  30-34
  三、试验方法  34-43
  四、结果与分析  43-47
  五、讨论  47-49
  六、本章小结  49-50
第三章抗苏丹红 I scFab抗体的原核表达  50-64
  一、实验材料、试剂与仪器  50-54
  二、实验方法  54-56
  三、结果与分析  56-62
  四、讨论  62-63
  五、本章小结  63-64
第四章 scFab抗体的复性与生物学活性鉴定  64-77
  一、实验材料、试剂与仪器  64-67
  二、实验方法  67-70
  三、结果与分析  70-73
  四、讨论  73-75
  五、本章小结  75-77
参考文献  77-82
综述  82-89
附录  89-90
致谢  90

新型基因工程抗体scFab的构建、表达及活性检测

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