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单增李斯特菌四环素耐药基因（tetM）接合转移的研究

作　者: 尹录
导　师: 李继昌
学　校: 东北农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 单增李斯特菌分离鉴定 tetM基因接合转移
分类号: S852.61
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

单增李斯特菌是近20年才逐步被人们认识的一种人畜共患病的致病菌。该菌是李斯特菌属中致病力最强的细菌,也是迄今发现唯一能对人致病的、典型的胞内寄生菌。该菌可引发脑膜炎、脑炎、败血症、心内膜炎、脓肿和局部的脓性损伤,也可造成孕妇流产、死胎等,其死亡率较高,可达30%以上。随着临床不断应用抗菌药物预防和治疗本病,导致不断出现对一种或多种抗菌药物耐受的单增李斯特菌株。其中发现最早、耐药性最高的是四环素耐药菌株,且研究表明,单增李斯特菌的四环素耐药株主要携带tetM耐药基因。tetM基因常与质粒、转座子等可移动成分相连,通过质粒和转座子在菌群间进行转移。tetM也能通过接合作用在单增李斯特菌株间,及从单增李斯特菌转移到粪肠球菌中。但目前为止,国内外尚未有文献报道单增李斯特菌四环素耐药株携带的tetM基因是否还能向其他致病菌转移。因此,为了进一步探讨单增李斯特菌四环素耐药基因的水平转移情况,也为了能够给阻止细菌耐药性的扩散和新型抗菌药物的研制提供理论基础,本试验对哈尔滨市市售鲜肉中分离的单增李斯特菌四环素耐药株携带的耐药基因tetM的水平传播进行了研究。联合应用科玛嘉显色培养基法、API试剂条法和PCR法,从哈尔滨市市售158件鲜肉(鸡肉、猪肉、牛肉、羊肉)中分离鉴定出23株单增李斯特菌,分离率为14.56%。其中,鲜猪肉分离率最高,达20.00%。采用纸片扩散法对分离的23株单增李斯特菌进行四环素耐药菌株的筛选。共筛选出3株四环素耐药株。另对其他20种抗菌药物进行药物敏感性测定,结果表明,除头孢噻吩外分离株对其余药物均存在不同程度的耐药情况。其中耐药率最高的是多黏菌素B,达65.2%;诺氟沙星、头孢噻肟、磷霉素、林可霉素和呋喃妥因的耐药率也较高,均在30.0%以上。且耐药谱分析表明,23株单增李斯特菌中仅有1株对21种抗菌药物敏感或中度敏感,其余分离株均对一种或多种抗菌药物产生耐药性。其中单耐药菌株占21.7%(5/23);二耐菌株占13.0%(3/23);三耐菌株占4.4%(1/23);四耐菌株占8.7%(2/23);五耐菌株占26.1%(6/23);六耐菌株占8.7%(2/23);七耐菌株占4.4%(1/23);十五耐菌株占8.7%(2/23),同时耐2种以上抗菌药的耐药菌株高达17株。采用PCR法对3株单增李斯特菌株四环素耐药株的耐药基因进行检测。结果表明,3株单增李斯特菌四环素耐药株均携带tetM基因,对四环素的耐受性与tetM基因的携带呈相关性。以单增李斯特菌四环素耐药株D38为供体菌株,以猪链球菌红霉素耐药株B22为受体菌株进行tetM基因的接合转移试验,采用PCR方法对接合子进行鉴定,并对受体菌株B22接合前后的耐药谱及tetM基因接合转移前后的序列进行比对。结果表明,在含有红霉素和四环素的选择性TSA-YE培养基上共得到接合菌株19株,接合转移率为3.8×10-7。且19株接合菌株中均扩增到受体菌株的特异性基因cps、红霉素耐药基因ermB及四环素耐药基因tetM,但没有扩增到供体菌特异性基因hly,说明供体菌株D38中的四环素耐药基因tetM通过接合作用转移到了受体菌B22中。耐药谱分析表明,受体菌株在成功接受tetM基因后,对四环素均由原来的敏感变为耐受。序列分析表明,tetM基因接合转移前后的序列同源性为100%。

全文目录

摘要  8-9
Abstract  9-11
1 引言  11-23
  1.1 单增李斯特菌的研究现状  11-18
    1.1.1 单增李斯特菌的生物学特性  11-13
    1.1.2 单增李斯特菌流行病学特征  13-15
    1.1.3 单增李斯特菌的检测方法  15-17
    1.1.4 单增李斯特菌的耐药情况  17-18
  1.2 细菌对四环素耐药的生化和遗传机制  18-21
    1.2.1 四环素类抗生素耐药的分子机制  18-20
    1.2.2 tet 基因的分布和转移  20-21
  1.3 研究的目的及意义  21-23
2 材料与方法  23-31
  2.1 试验材料  23-24
    2.1.1 样品及菌株  23
    2.1.2 试验试剂  23
    2.1.3 主要仪器  23-24
  2.2 试验方法  24-31
    2.2.1 鲜肉中单增李斯特菌的增菌与分离培养  24
    2.2.2 单增李斯特菌的鉴定  24-25
    2.2.3 四环素耐药菌株的筛选及其他常用药物敏感性的分析  25-26
    2.2.4 四环素耐药菌株tetM 基因的扩增  26-27
    2.2.5 四环素耐药基因tetM 的接合转移试验  27-31
3 结果与分析  31-44
  3.1 单增李斯特菌分离情况  31
  3.2 单增李斯特菌鉴定结果  31-34
    3.2.1 菌落特征  31-33
    3.2.2 API Listeria 鉴定结果  33-34
    3.2.3 PCR 方法鉴定结果  34
  3.3 四环素耐药菌株的筛选及其他常用药物敏感性测定结果  34-37
  3.4 四环素耐药菌株tetM 扩增结果  37-38
  3.5 四环素耐药基因tetM 的接合转移结果  38-44
    3.5.1 猪链球菌B22（受体菌）cps、ermB 基因的PCR 鉴定结果  38-39
    3.5.2 接合试验结果  39
    3.5.3 接合子的PCR 鉴定结果  39-41
    3.5.4 接合子及猪链球菌B22（受体菌）的药物敏感性测定结果  41-42
    3.5.5 接合子tetM 基因的克隆与序列测定结果  42-44
4 讨论  44-51
  4.1 单增李斯特菌的分离鉴定  44-46
    4.1.1 有关单增李斯特菌的分离鉴定的分析  44-45
    4.1.2 有关单增李斯特菌在食品中的分离情况分析  45-46
  4.2 单增李斯特菌对常用抗菌药物敏感性分析  46
  4.3 单增李斯特菌四环素耐药机制的初步研究  46-47
  4.4 单增李斯特菌四环素耐药基因转移的研究  47-51
    4.4.1 细菌耐药性扩散机制  47-48
    4.4.2 四环素的耐药转移  48-49
    4.4.3 单增李斯特菌的四环素耐药转移  49-51
5 结论  51-52
致谢  52-53
参考文献  53-60
攻读硕士期间发表的学术论文  60

单增李斯特菌四环素耐药基因（tetM）接合转移的研究

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