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RNA干扰靶向抑制PI3K p85α表达对5-FU诱导大肠癌细胞凋亡的影响

作　者: 杨慧
导　师: 宋于刚
学　校: 南方医科大学
专　业: 内科学
关键词: PI3K p85α 大肠癌 细胞蛋白 hoechst33258染色 JC-1 线粒体膜电位
分类号: R735.34
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


大肠癌(colorectal carcinoma,CRC)是消化系统最常见的恶性肿瘤之一,其发病率在世界不同地区差异很大,以北美、大洋州最高,欧洲居中,亚非地区较低。我国南方,特别是东南沿海明显高于北方,发病率仅次于胃癌、食管癌。近20多年来,世界上多数国家大肠癌发病率呈上升趋势,据调查统计,世界上大肠癌的发病率正以每年2%的速度上升,在我国随着经济的进步,生活方式和饮食结构的变化,尤其是高脂肪、高蛋白、高热量、低纤维素的饮食,我国的大肠癌发病率每年也快速递增,特别是大城市上升趋势更为显著,据上海的调查显示,我国大肠癌发病率的增速是世界平均水平的两倍,达到年均增加4%。然而,大肠癌的治疗效果并不理想,大肠癌传统治疗方法,即外科手术治疗、放射治疗和化学药物治疗方法的不断发展和完善,在延长患者生存期和提高患者生存质量方面取得了长足的进步；但是手术和放疗是局部治疗,难以控制肿瘤的复发和转移,化疗虽为全身性治疗,但组织选择性和特异性差,毒副作用明显。FOLFOX方案是国内外认可的大肠癌化疗方案,其中临床最为常用的是“5-氟尿嘧啶+亚叶酸钙+铂类”,但近年来临床上频有报道大肠癌对5-FU的耐药现象,为了保证治疗效果,临床多推荐使用多种化疗药物联合,但化疗药物缺乏组织选择性和特异性,对骨髓等高代谢正常人体重要器官和组织产生严重的毒副作用,反而不仅影响了患者的生存质量,还增加了患者精神压力和经济负担。因此,探寻大肠上皮细胞癌变、演化和转移的机制,早期发现和干预大肠癌的生物学进程,以及增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,从而减轻化疗药物带来的副作用,对大肠癌的治疗具有重要的意义。近年来,3-磷脂酰肌醇激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)和AKT通路逐渐引起了人们的关注。PI3K-AKT信号通路作为细胞内重要信号转导通路之一,参与增值、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节。3-磷脂酰肌醇激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)家族成员属于原癌基因,是一种可使肌醇环第三位羟基磷酸化的磷脂酰肌醇激酶,已发现三种PI3K同工酶。近年来发现,IA型PI3K和其下游分子蛋白激酶(PI3K/Akt信号通路)与肿瘤的发生发展密切相关,该通路调节肿瘤细胞的增殖和存活,其活性异常不仅能导致细胞恶性转化,而且与肿瘤细胞的迁移、粘附、肿瘤血管生成以及细胞外基质的降解等相关。在PI3K家族中,研究最广泛的是能被细胞表面受体所激活的IA型PI3K,哺乳动物细胞中IA型PI3K从酪氨酸激酶连接受体传递信号,IA型PI3K是由p85α/β/γ(调节亚基)和p110α/β/δ/γ(催化亚基)组成的异二聚体,研究表明,PI3K/Akt通路中的组成成分广泛的人类肿癌普中表达失调,特别是PI3K的调节亚基p85α在现有的研究中均显示出其在大肠癌细胞中突变的比率较高,本课题组已通过免疫组化方法证实了在正常肠粘膜组织、大肠息肉、大肠腺瘤、大肠癌组织中p85α表达呈上升趋势,PI3K p85α的表达水平与大肠癌的演进成显著正相关关系,并且相关关系非常密切,提示PI3K p85α在大肠癌演化过程中可能起重要作用,而且还进一步证实PI3K p85α表达水平和大肠癌的恶性程度有关,PI3K p85α的表达水平与大肠癌的Dukes分期成显著正相关关系。PI3K通过两种方式激活,一种是通过调节亚基p85α与具有磷酸化酪氨酸残基的生长因子受体或连接蛋白相互作用,引起二聚体构象改变而被激活；另一种是通过Ras和p110直接结合导致PI3K的活化。PI3K激活的结果是在质膜上产生第二信使PIP3,PIP3作为一种配体把含有PH结构域的蛋白聚集到细胞膜上,使它们被膜上激酶磷酸化,激活的蛋白可以引起下游的信号转导通路。在PIP3作用的众多底物中,最引人关注的是AKT,即细胞内反转录病毒v-AKT的同源物。AKT作为蛋白激酶,它对细胞生存机制和抗凋亡的调控是通过对一系列底物的磷酸化而完成的。AKT能直接磷酸化多种转录因子,通过调控这些转录因子可以抑制凋亡基因的表达和增强抗凋亡基因的表达,从而促进细胞的存活。前者的一个典型例子是转录因子Forkhead蛋白家族。它的三个成员FoxO1、FKHRL1和AFX都含有保守的AKT磷酸化序列,在体外能迅速被AKT磷酸化。AKT是通过改变Forkhead蛋白在细胞内的定位来起作用的。AKT激活时,磷酸化Forkhead蛋白使其发生细胞核内到细胞核外转位,磷酸化的Forkhead蛋白能抑制促凋亡基因的转录功能,Forkhead蛋白的靶基因包括FasL、TRAIL和Bcl-6、Bim、Bax,从而负调控凋亡信号,促进细胞存活,甚至发生恶变。目前,通过基因干预方法敲除或小分子药物抑制PI3K-AKT相关基因,阻断其下游多种抗凋亡效应分子的活化,促进细胞凋亡已成为肿瘤治疗研究的热点,本课题组已成功应用RNA干扰技术构建了抑制PI3K p85α表达的大肠癌LoVo、SW480稳定表达细胞株LoVo(shRNA/324)(L324)、SW480(shRNA/1124)(SW1124),实验证明抑制PI3K p85α表达后,磷酸化AKT、FoxO蛋白表达降低,细胞核内FoxO蛋白含量增高,细胞生长活力抑制,细胞周期停滞于G0/G1期,但单独抑制PI3K p85α表达后,并未发现明显的凋亡现象。有研究资料显示沉默PI3K p85α表达后,可增加癌细胞对化疗药物的敏感性,遂本实验将进一步在RNA干扰抑制PI3K p85α表达的基础上,研究转染细胞L324、SW1124对化疗药物5-FU的敏感性是否较对照组LoVo、SW480细胞显著增加,并对其机制进行初步探讨。材料与方法一、PI3K p85α在大肠癌癌变过程中的表达及临床意义应用Western blot方法检测PI3K p85α蛋白在大肠粘膜正常组织、大肠息肉、大肠腺瘤以及原发性大肠癌组织中的表达情况。二、RNA干扰靶向抑制PI3K p85α表达后,大肠癌细胞LoVo、SW480对5-FU敏感性的变化。1、MTT法计算对照组LoVo、SW480细胞和转染组L324、SW1124细胞5-FU的IC50(50% inhibitory concentration)值。2、Hoechst33258染色观察5-FU刺激LoVo和L324、SW480和SW1124细胞48小时后,倒置荧光显微镜下观察细胞核形态改变,200×视野下选择5个典型视野,每个视野计数200个细胞,并计算每个视野凋亡核所占比率,记为该组细胞的凋亡率,并根据凋亡率的差异反映各组大肠癌细胞对5-FU敏感性的差异。3、JC-1线粒体膜电位检测方法检测5-FU刺激LoVo和L324、SW480和SW1124细胞48小时后,倒置荧光显微镜下观察细胞浆内线粒体膜电位的变化,200×视野下选择5个典型视野,每个视野计数200个细胞,并计算每个视野红色荧光细胞所占比率,从而比较各组大肠癌细胞对5-FU敏感性的差异。4、Western blot检测5-FU刺激LoVo和1324、SW480和SW1124四种细胞48小时后,凋亡蛋白Bax、Bcl-6、Bim表达的差异。三、统计学分析所有结果均经SPSS13.0统计软件统计。数据以均数±标准差(χ±s)表示,两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),以P<0.05为差异有统计学意义。结果一、PI3K p85α在大肠癌癌变过程中的表达及临床意义Western blot方法检测结果表明在大肠粘膜正常组织、大肠息肉、大肠腺瘤和大肠癌组织中的PI3K p85α蛋白表达差异显著,具有统计学意义,F=451.126,P=0.000,表达呈上升趋势。大肠癌与正常肠粘膜组织、大肠息肉、大肠腺瘤比较,P值分别为0.006、0.002、0.007,大肠癌组织中表达量最高,较其他组均显著升高,大肠腺瘤与正常肠粘膜、大肠息肉比较,P值分别为0.006、0.001,说明PI3Kp85α蛋白在大肠癌癌前病变-腺瘤中的表达亦显著增加。二、RNA干扰靶向抑制PI3K p85α表达对5-FU诱导大肠癌细胞LoVo、SW480凋亡的影响1、MTT法检测LoVo、L324、SW480、SW1124四组细胞5-FU的IC50值,L324细胞的5-FU IC50值(4.57±0.16μmol/L)较对照细胞LoVo的5-FU IC50值(8.07±0.30μmol/L)显著降低,t=39.268,P=0.000；SW1124细胞的5-FU IC50值(19.04±5.22μmol/L)较对照细胞SW480的5-FU IC50值(33.61±12.19μmol/L)显著降低,t=42.552,P=0.000,具有统计学意义。2、Hoechst33258染色结果示：0.01μmol/mL5-FU刺激转染组L324和对照组LoVo细胞48小时后,倒置荧光显微镜下观察可见L324细胞中细胞核出现明显的皱缩、折叠甚至碎裂等凋亡核表现,计算凋亡率为0.63±0.04较对照组LoVo细胞0.294±0.04显著增高,两组凋亡率差异显著,具有统计学意义,t=23.674,P=0.000。0.03μmol/mL 5-FU刺激转染组SW1124和对照组SW480细胞48小时后,倒置荧光显微镜下观察可见转染组SW1124细胞中细胞核出现明显的凋亡核表现,计算凋亡率为0.614±0.05较对照组SW480细胞0.20±0.02显著增高,两组凋亡率差异显著,t=31.504,P=0.000。3、JC-1线粒体膜电位检测结果示：0.01μmol/L5-FU刺激转染组L324和对照组LoVo细胞48小时后,倒置荧光显微镜下观察可见L324细胞中红色荧光细胞数显著减少,红色荧光细胞所占比率0.03±0.02较对照组LoVo细胞0.24±0.03差异显著,t=20.672,P=0.000。0.03μmol/L 5-FU刺激转染组SW1124和对照组SW480细胞48小时后,SW1124细胞组红色荧光细胞所占比率0.04±0.02较对照SW480细胞0.32±0.05显著降低,t=21.228,P=0.000,具有统计学意义。4、western blot检测5-FU刺激后LoVo、L324、SW480、SW1124细胞48小时后,凋亡蛋白Bax、Bcl-6、Bim的表达。结果显示L324、SW1124细胞中各凋亡蛋白的表达量较LoVo、SW480细胞显著增加,差异具有统计学意义,P=0.000。结论1、PI3K p85a蛋白的表达在大肠正常粘膜、大肠息肉、大肠腺瘤、大肠癌组织中呈上升趋势,说明PI3K p85α在大肠癌的发生发展中起重要作用,值得注意的是PI3K p85α在大肠癌癌前病变-腺瘤中表达亦显著增加,提示PI3K p85α可能成为大肠癌早期诊断的标志物以及大肠癌靶向治疗的新靶点。2、转染组L324、SW1124细胞5-FU的IC50值较对照组LoVo、SW480细胞5-FU的IC50值显著降低,说明抑制PI3K p85α表达后,可明显增加大肠癌细胞对化疗药物5-FU的敏感性,降低5-FU的治疗浓度,亦很大程度的减轻5-FU的毒副作用。为临床解决大肠癌细胞对5-FU耐药的问题,提供理论依据,使基因治疗和化疗联合治疗大肠癌成为可能。3、抑制PI3K p85α表达后,Hoechst33258染色和JC-1线粒体膜电位检测均从形态学上显示转染组L324、SW1124细胞对5-FU的敏感性较对照组LoVo、SW480细胞显著增加,支持了MTT结果。4、RNA干扰靶向抑制PI3K p85α表达,5-FU刺激48小时后,转染组L324、SW1124细胞中凋亡蛋白Bax、Bcl-6、Bim的表达均分别较对照组LoVo、SW480细胞中各凋亡蛋白的表达量显著增加,此结果说明RNA靶向抑制PI3K p85α表达增加大肠癌细胞对化疗药物5-FU的敏感性,其机制可能与凋亡蛋白Bax、Bcl-6、Bim表达增加有关,这项研究在国内外尚属首例。

全文目录


摘要  3-9
ABSTRACT  9-15
第一章 前言  15-23
第二章 材料与方法  23-32
第三章 结果  32-46
第四章 讨论  46-52
全文小结  52-54
参考文献  54-60
攻读学位期间成果  60-61
中英文缩写词对照表  61-63
致谢  63-65
统计学证明  65

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肠肿瘤 > 大肠肿瘤
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